一种枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术属于微生物领域，公开了一种枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。本发明专利技术所述枯草芽孢杆菌其为枯草芽孢杆菌菌株中purD

A Bacillus subtilis and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，尤其是涉及一种产腺苷的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。
技术介绍
腺苷即腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物，属于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷除了可以用作治疗心脏的特效药物之外，还是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体，广泛应用于医药等行业。腺苷的生产方法主要有三种，化学合成法、RNA水解法和发酵法。化学合成法是以不同化学物质为底物进行化学合成腺苷，例如以次黄嘌呤为起始原料，经与三氯氧磷反应制得6-氯嘌呤。6-氯嘌呤再与四乙酰核糖在特制的催化剂作用下发生缩合反应，缩合物在0℃饱和的氨甲醇作用下氨解制得腺苷。然而化学法合成腺苷溶剂损耗量大，成本高，收率低，产量低等缺点，并且对环境的污染较为严重，不适合大规模的产业化。RNA水解法是用糖类原料培养出酵母菌体，由菌体分离RNA后，水解RNA得到肌苷酸(IMP)，再通过IMP合成腺苷。但是RNA的降解过程中会产生4种核苷酸的混合物，给后面的分离提取过程带来了非常大的难度，而且增加了成本。微生物发酵法因为其环保，原料成本低，反应条件温和、易控制，原料来源广泛等优点成为腺苷生产的主要方法。优良的生产菌株选育是腺苷发酵的关键。但目前腺苷的菌种的发酵性能仍较差、腺苷的转化率仍较低，仍不能满足大规模工业化生产的需求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种腺苷的转化率高的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌菌株中下述至少一个位点发生了点突变：1)purDP116L：甘氨酰胺核苷酸合成酶基因purD的第116位脯氨酸突变为亮氨酸；2)purRA65D：转录调节子基因purR的第65位丙氨酸突变为天冬氨酸；3)guaBG279R：肌苷酸脱氢酶基因guaB的第279位甘氨酸突变为精氨酸。在一些实施方案中，所述的枯草芽孢杆菌其为菌株中所述三个位点均发生点突变。作为优选，所述枯草芽孢杆菌为B.subtilis168菌株。本专利技术还提供了上述枯草芽孢杆菌的构建方法，包括：步骤A、采用基因无痕编辑法构建枯草芽孢杆菌(Δupp)菌株；步骤B、分别制备purDP116L、purRA65D、guaBG279R三个点突变基因片段，与载体连接分别获得三个单一位点突变质粒；步骤C、三个单一点突变质粒分别转化枯草芽孢杆菌(Δupp)菌株获得单一位点突变的枯草芽孢杆菌。在一些实施方案中，所述枯草芽孢杆菌为B.subtilis168菌株。在一些具体实施方案中，所述的构建方法中步骤A所述构建B.subtilis168(Δupp)菌株的方法具体为用引物upp-1f/1r、upp-2f/2r，以B.subtilis168基因组为模板，使用pfuDNA聚合酶扩增分别得到888bp和938bp的上下游同源臂；用引物upp-1f/2r扩增得到上下游融合片段，将片段与载体质粒连接通过Spizizen转化至B.subtilis168菌株筛选获得B.subtilis168(Δupp)菌株；其中，所述upp-1f的序列如SEQIDNo.1所示；所述upp-1r的序列如SEQIDNo.2所示；所述upp-2f的序列如SEQIDNo.3所示；所述upp-2r的序列如SEQIDNo.4所示。在一些具体实施方案中，所述的构建方法中所述筛选具体为用含2.5μg/mL氯霉素的LB平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含5μg/mL的氯霉素LB平板获得一次重组子；将一次重组子接到LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μM5-FU的LB平板筛选二次重组子即B.subtilis168(Δupp)菌株。在一些实施方案中，所述的构建方法中步骤B所述载体为pKSU。在一些具体实施方案中，所述三个单一位点突变质粒分别为pKSU-purD*、pKSU-purR*和pKSU-guaB*，单一位点突变的枯草芽孢杆菌分别为B.subtilisA1、B.subtilisA2、B.subtilisA3菌株。在另一些实施方案中，所述枯草芽孢杆菌的构建方法步骤C为三个单一点突变质粒依次转化B.subtilis168(Δupp)菌株获得三个位点均发生点突变的枯草芽孢杆菌B.subtilisA5。本领域技术人员可以理解，本专利技术所述枯草芽孢杆菌并不限定为B.subtilis168菌株。其它枯草芽孢杆菌亦可。本专利技术还提供了上述枯草芽孢杆菌在发酵生产腺苷中的应用。本专利技术还提供了一种腺苷的生产方法，将上述枯草芽孢杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵。其中，所述种子培养基配方(g/L)为：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH7.0～7.2；所述发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖60，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH7.0～7.2；所述发酵条件为36℃，发酵48h。由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。本专利技术所述枯草芽孢杆菌其为枯草芽孢杆菌菌株中purDP116L、purRA65D或guaBG279R中至少一个位点发生了点突变。purDP116L或purRA65D的突变条件下，腺苷合成途径的反馈抑制或反馈阻遏被解除，guaBG279R突变条件下腺苷的竞争代谢途径被阻断，可实现腺苷的大量积累。purDP116L、purRA65D或guaBG279R单一位点突变分别获得枯草芽孢杆菌B.subtilisA1、B.subtilisA2、B.subtilisA3菌株。三个单一点突变质粒依次转化B.subtilis168(Δupp)菌株获得三个位点均发生点突变的枯草芽孢杆菌B.subtilisA5。实验显示，同出发菌株B.subtilis168-Δupp相比，工程菌的腺苷积累量都有提高，A1积累最少，A2积累较多，A3菌株积累的腺苷较A2少，但鸟苷积累减少，三个位点均发生点突变的A5菌株腺苷积累最多，说明这三个位点的突变在腺苷积累中起到了主要作用。表明本专利技术所述枯草芽孢杆菌为腺苷高产菌株，能有效积累腺苷，提高腺苷的产量，为腺苷的工业化生产奠定了基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1菌株产苷水平比较。具体实施方式本专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及产品已经通过较佳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，枯草芽孢杆菌菌株中下述至少一个位点发生了点突变：1)purD

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，枯草芽孢杆菌菌株中下述至少一个位点发生了点突变：1)purDP116L：甘氨酰胺核苷酸合成酶基因purD的第116位脯氨酸突变为亮氨酸；2)purRA65D：转录调节子基因purR的第65位丙氨酸突变为天冬氨酸；3)guaBG279R：肌苷酸脱氢酶基因guaB的第279位甘氨酸突变为精氨酸。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，菌株中所述三个位点均发生点突变；所述菌株为工程菌B.subtilis168。3.权利要求1所述枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括：步骤A、采用基因无痕编辑法构建枯草芽孢杆菌(Δupp)菌株；步骤B、分别制备purDP116L、purRA65D、guaBG279R三个点突变基因片段，与载体连接分别获得三个单一位点突变质粒；步骤C、三个单一点突变质粒分别转化枯草芽孢杆菌(Δupp)菌株获得单一位点突变的枯草芽孢杆菌。4.根据权利要求3所述枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤C、三个单一点突变质粒依次转化枯草芽孢杆菌(Δupp)菌株获得三个位点均发生点突变的枯草芽孢杆菌。5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌(Δupp)菌株为B.subtilis168菌株；步骤A所述构建枯草芽孢杆菌(Δupp)菌株的方法具体为用引物upp-1f/1r、upp-2f/2r，以B.subtilis168基因组为模板，使用pfuDNA聚合酶扩增分别得到888bp和938bp的上下游同源臂；用引物upp-1f/2r扩增得到上下游融合片段，将片段与载体质粒连接通过Spi...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡丹，袁辉，吴涛，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13