【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其涉及一种a-异丙基苹果酸合酶突变体及其应用。
技术介绍
1、支链氨基酸(branch chain amino acid，bcaa)包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。其中，l-缬氨酸(l-valine)，化学名称为l-α-氨基异戊酸，分子式为c5h11no2，相对分子质量为117.15。l-缬氨酸呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中25℃的溶解度为88.5g/l，50℃的溶解度为96.2g/l，不溶于冷乙醇、乙醚、丙酮，等电点为5.96，熔点为315℃。
2、l-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。l-缬氨酸可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。其中，在医药工业中，l-缬氨酸可作为氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。在食品工业中，l-缬氨酸可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。l-缬氨酸也可用作氨基酸功能饮料与运动员饮料，具有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。在饲料工业中，l-缬氨酸对动物的乳腺组织分泌乳汁具有重要的促进作用。
3、目前，l-缬氨酸的生产方法主要包括三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受到限制、生产成本高、污染环境等问题，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产l-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产l-缬氨酸最主要的方法。但目前l-缬氨酸菌种的发酵性能仍较差，且副产物亮氨酸的含量较高
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种a-异丙基苹果酸合酶突变体及其应用。
2、第一方面，本专利技术提供一种a-异丙基苹果酸合酶的突变体，所述突变体为将a-异丙基苹果酸合酶的第246位由亮氨酸突变为其他氨基酸得到。
3、进一步地，所述a-异丙基苹果酸合酶包括如seq id no.1所示的氨基酸序列。
4、进一步地，所述突变体为将a-异丙基苹果酸合酶的第246位由亮氨酸突变为甲硫氨酸、缬氨酸或脯氨酸。三种突变体对应的氨基酸序列为seq id no.3-5。
5、本专利技术进一步提供用于编码所述突变体的核酸，对应的核苷酸序列为seq idno.6-8。
6、第二方面，本专利技术提供一种重组微生物，所述重组微生物中的a-异丙基苹果酸合酶的第246位由亮氨酸突变为甲硫氨酸、缬氨酸或脯氨酸中的一种或多种。
7、进一步地，所述a-异丙基苹果酸合酶包括如seq id no.1所示的氨基酸序列。
8、进一步地，所述a-异丙基苹果酸合酶的编码基因包括如seq id no.2所示的核苷酸序列。
9、进一步地，所述重组微生物还进行如下编辑方式的任意一种或多种：
10、i)ilvn蛋白第25位从缬氨酸突变为异亮氨酸；
11、ii)ilvc蛋白第90位从异亮氨酸突变为丝氨酸；
12、iii)提高ppc基因的表达水平；
13、iv)提高gnda基因的表达水平；
14、v)将ilvd蛋白第237位突变由丙氨酸突变为赖氨酸。
15、其中iii)和iv)中提高基因的水平，可以通过替换强启动子、增加拷贝数或是基因突变的方式提高基因的表达水平，例如将ppc基因和gnda基因的启动子替换为ptac。
16、进一步地，ilvd蛋白在ncbi上的参考序列编号为wp_003854128.1，其核苷酸序列在ncbi上的参考序列编号为cey17_rs06870。
17、进一步地，ilvc蛋白在ncbi上的参考序列编号为wp_003854117.1，其核苷酸序列在ncbi上的参考序列编号为cey17_rs06895。
18、进一步地，ilvn蛋白在ncbi上的参考序列编号为wp_003861429.1，其核苷酸序列在ncbi上的参考序列编号为cey17_rs06890。
19、进一步地，ppc、gnda基因在ncbi上的参考序列编号分别为cey17_rs08480、cey17_rs07800。
20、进一步地，所述重组微生物为谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌、黄色短杆菌或大肠杆菌。
21、本专利技术进一步提供所述突变体或所述核酸在提高微生物生产氨基酸或其衍生物的能力中的应用。
22、进一步地，所述微生物为谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌、黄色短杆菌或大肠杆菌。
23、进一步地，所述氨基酸为支链氨基酸；优选为缬氨酸。
24、本专利技术进一步提供一种提高微生物生产氨基酸或其衍生物的能力的方法，包括：
25、将所述微生物中a-异丙基苹果酸合酶的第246位由亮氨酸突变为甲硫氨酸、缬氨酸或脯氨酸中的一种或多种。
26、进一步地，还包括如下任意一种编辑方式：
27、i)ilvn蛋白第25位从缬氨酸突变为异亮氨酸；
28、ii)ilvc蛋白第90位从异亮氨酸突变为丝氨酸；
29、iii)提高ppc基因的表达水平；
30、iv)提高gnda基因的表达水平；
31、v)将ilvd蛋白第237位突变由丙氨酸突变为赖氨酸。
32、本专利技术具备如下有益效果：
33、本专利技术发现一种a-异丙基苹果酸合酶的突变体，即将a-异丙基苹果酸合酶的第246位氨基酸突变为其他氨基酸时可以显著提高微生物生产支链氨基酸的能力，尤其当突变为甲硫氨酸、缬氨酸或脯氨酸时效果产量提升较大。本专利技术进一步在该突变体的基础上，进行二羟酸脱水酶、乙酰羟酸异构还原酶、乙酰羟酸合酶、gnda基因或ppc基因的编辑，可以进一步提高微生物生产支链氨基酸的产量，这对于提高支链氨基酸产量的领域具有重要意义。
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1.一种a-异丙基苹果酸合酶的突变体，其特征在于，所述突变体为将a-异丙基苹果酸合酶的第246位由亮氨酸突变为其他氨基酸得到。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述a-异丙基苹果酸合酶包括如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述突变体为将a-异丙基苹果酸合酶的第246位由亮氨酸突变为甲硫氨酸、缬氨酸或脯氨酸。
4.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码权利要求1-3任一项所述的突变体。
5.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的a-异丙基苹果酸合酶的第246位由亮氨酸突变为甲硫氨酸、缬氨酸或脯氨酸中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述a-异丙基苹果酸合酶包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求5或6所述的微生物，其特征在于，所述重组微生物还包括如下突变的任意一种或多种：
8.根据权利要求5或6所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌、黄色短
9.一种提高微生物生产支链氨基酸能力的方法，其特征在于，包括：
10.权利要求1-3任一项所述的突变体或权利要求4所述的核酸在提高微生物的生产氨基酸或其衍生物的能力中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种a-异丙基苹果酸合酶的突变体，其特征在于，所述突变体为将a-异丙基苹果酸合酶的第246位由亮氨酸突变为其他氨基酸得到。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述a-异丙基苹果酸合酶包括如seq idno.1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述突变体为将a-异丙基苹果酸合酶的第246位由亮氨酸突变为甲硫氨酸、缬氨酸或脯氨酸。
4.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码权利要求1-3任一项所述的突变体。
5.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的a-异丙基苹果酸合酶的第246位由亮氨酸突变为甲硫氨...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，栾明月，姚佳琪，张孟娟，李岩，赵津津，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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