一种高产L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产L‑乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术提供的一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FMME‑BC，利用其发酵生产L‑乳酸产量达151.3g/L，光学纯度达97.1％，同时其可以接受外源DNA电转化，进行基因工程改造，敲除凝结芽孢杆菌FMME‑BC中D‑乳酸脱氢酶基因，得到的突变株FMME‑BCM，其发酵生产L‑乳酸产量达到185.1g/L，旋光度达到100％。

A Bacillus coagulans with high L-lactic acid production and its application

【技术实现步骤摘要】
一种高产L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及一种高产L-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用，属于生物工程

技术介绍
乳酸(Lacticacid)，学名α-羟基丙酸，分子式为C3H6O3，是世界上公认的三大有机酸之一。L-乳酸在食品、医药、农业、化妆品等众多领域有着广泛的应用，特别是高光学纯度的L-乳酸，L-乳酸聚合而成的聚乳酸因其有生物降解性和生物相容性而被广泛用于生产可生物降解塑料。20世纪80年代，我国约有50多家小乳酸厂，数年来，随着市场竞争逐渐淘汰至10家左右，年产能合计约20万吨。但近两年，随着聚乳酸生产技术的进步及下游应用领域开拓所带来的巨大市场空间，行业内企业及新进入者开始看好乳酸行业未来发展前景，先后投资建厂以扩大乳酸产能。微生物发酵已成为乳酸生产最成熟的方法。微生物发酵具有产量高、产品纯度高、反应条件温和、不受任何环境污染等优点。微生物发酵原料通常是葡萄糖、玉米淀粉、马铃薯淀粉等。发酵所用菌种主要包括芽孢杆菌、乳杆菌、根霉、曲霉以及工程菌株。传统乳酸发酵采用的菌种主要为乳酸菌和米根霉等。乳酸菌发酵生产L-乳酸多为同型发酵，具有较高的转化率，因而成为主要的工业菌种，针对乳酸菌的基因工程改造工作也取得了长足的发展。嗜热的芽孢杆菌是一种新的可用于L-乳酸发酵生产的微生物，具有较高的糖酸转化率。由于嗜热芽孢杆菌可以在45～60℃正常生长，对营养成分要求不高，极大地减少了发酵过程中污染杂菌的可能，以较高的温度进行发酵，可降低发酵液粘度，有利于后续处理步骤的操作。目前，虽然凝结芽孢杆菌发酵产L-乳酸的研究很多，但是大多数凝结芽孢杆菌尚无可成熟的基因操作系统，进行遗传操作的菌株并不常见。关于可在凝结芽孢杆菌中自主复制质粒的报道很少，而且菌株电转化及敲除等遗传操作效率并不高。现报道只有两种凝结芽孢杆菌DSMl和P4-102B可以接受外源DNA电转化、基因敲除等遗传操作，但是这两株菌发酵生产L-乳酸产率很低，其中SunLF等人利用凝结芽孢杆菌DSMl以葡萄糖为底物发酵生产L-乳酸，在50℃条件下，发酵24h，乳酸产量仅为49.4g/L，产物的光学纯度为99.8％，产率达2.06g/L/h(Scientificreports,2016,6:37916)；WangQZ利用凝结芽孢杆菌P4-102B以葡萄糖为底物发酵生产L-乳酸，在50℃下发酵48h获得光学纯度100％的L-乳酸，L-乳酸产量仅为336.4mM(30.3g/L)，葡萄糖得率为0.89g/g(PNAS,2011,108(47):18920-18925.)。因此，无法满足工业上生产L-乳酸的需求。
技术实现思路
为了解决上述存在的技术问题，本专利技术提供了一株凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)FMME-BC，利用其发酵生产L-乳酸产量达151.3g/L，光学纯度达97.1％，同时其可以接受外源DNA电转化，进行基因工程改造，敲除凝结芽孢杆菌FMME-BC中D-乳酸脱氢酶基因，得到的突变株FMME-BCM，其发酵生产L-乳酸产量达到185.1g/L，旋光度达到100％。本专利技术的第一个目的是提供一株凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，所述凝结芽孢杆菌已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019436，保藏地址为中国武汉武汉大学。本专利技术的第二个目的是提供所述凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)的感受态细胞。本专利技术的第三个目的是提供一种制备所述感受态细胞的方法，所述制备包括在细胞培养过程中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在一种实施方式中，所述CTAB的浓度为0.02％(w/v)。在一种实施方式中，所述感受态细胞制备方法具体为：从甘油管中挑取FMME-BC划线至LB固体培养基平板上，挑取单菌落接种至装有25mLGM液体培养基的250mL三角瓶中，50℃静置培养过夜，1％～2％的接种量转接至装有80mLGM液体培养基的500mL三角瓶中，50℃，200rpm培养至OD600约为0.4，加入0.02％的CTAB继续培养直OD600为0.6～0.8，冰上预冷细胞15～30min，5000rpm，4℃离心收集菌体。用40mL预冷的电转缓冲液SG洗涤菌体3次。加800μL的SG重悬洗涤后的菌体，分装到1.5mL的离心管中，每管200μL，-80℃保存备用。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化具体为，向200μL感受态细胞中加入8～16μg质粒DNA，冰浴10～20min后转移至预冷的电转杯中，电压设置1.5kv，电击时间控制在5.0～6.0ms。电击后迅速加入600～1000μL复苏培养基RM，75～80℃下热击60s，转移至50℃摇床中，200rpm培养2～3h后涂布平板，培养后进行筛选。本专利技术的第四个目的是提供所述凝结芽孢杆菌在基因工程领域的应用，所述应用是在所述凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)的基础上进行基因工程改造。在一种实施方式中，所述基因工程改造是敲除所述凝结芽孢杆菌的D-乳酸脱氢酶基因。在一种实施方式中，所述D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在一种实施方式中，所述D-乳酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第五个目的是提供根据所述应用得到的基因工程菌。本专利技术的第六个目的是提供一种生产L-乳酸的方法，所述方法是应用所述凝结芽孢杆菌或所述基因工程菌进行发酵生产。在一种实施方式中，所述发酵生产是将所述凝结芽孢杆菌或所述突变菌的种子液接种到发酵培养基中进行发酵生产。在一种实施方式中，所述发酵培养基(g/L)的组成为：工业葡萄糖100～120，玉米浆5～10，MgSO40.5～1.0，调节pH为6.0。本专利技术的第七个目的是提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有所述凝结芽孢杆菌或所述基因工程菌。本专利技术的第八个目的是提供一种组合物，所述组合物含有所述凝结芽孢杆菌或所述基因工程菌。本专利技术还提供所述凝结芽孢杆菌或所述基因工程菌在制备L-乳酸或其衍生产品方面的应用。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术提供的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)FMME-BC，利用其发酵生产L-乳酸产量达151.3g/L，光学纯度达97.1％；(2)同时本专利技术筛选的凝结芽孢杆菌FMME-BC可以接受外源DNA电转化，进行基因工程改造。将基因组上D-乳酸脱氢酶基因敲除，获生产高纯度L-乳酸的突变株FMME-BCM，其发酵生产L-乳酸产量达到185.1g/L，旋光度达到100％。生物材料保藏本专利技术所提供的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)FMME-BC，分类学命名为BacilluscoagulansFMME-BC，已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019436，保藏地址为中国武汉武汉大学。附图说明图1：双交换法敲除ldhD基因PCR验证；(a)M:Maker；1:第一次重组后PCR验证6.1kb；2:第二次重组后PCR验证1.9kb；3：野生型对照2.9kb.(b)M:Maker；1：引物ldhD-up和ldhD-downPCR突变株；2：引物ldhD-up和ldh本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019436，保藏地址为中国武汉武汉大学。

【技术特征摘要】
1.一株凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019436，保藏地址为中国武汉武汉大学。2.权利要求1所述凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)的感受态细胞。3.一种制备权利要求2的感受态细胞的方法，其特征在于，所述制备包括在细胞培养过程中加入十六烷基三甲基溴化铵。4.权利要求1所述凝结芽孢杆菌在基因工程领域的应用，其特征在于，所述应用是在所述凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)的基础上进行基因工程改造。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳，刘立明，罗秋玲，陈修来，宋伟，
申请(专利权)人：江南大学，无锡宸明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32