T细胞受体制造技术

一种T细胞受体(TCR)，其具有结合gp100YLEPGPVTA肽-HLA-A2复合物的特性并包含TCRα可变域和/或TCRβ可变域，其特征在于：相对于具有胞外α和β链序列SEQ ID No：2和3的TCR，所述TCR在SEQ ID No：2所示其α链可变域氨基酸1到109和/或在SEQ ID No：3所示其β链可变域氨基酸1到112发生突变，且所述TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是参比TCR的至少两倍，所述参比TCR具有胞外α链序列SEQ ID No:45和胞外β链序列SEQ ID No:46。还描述了此类TCR在过继性治疗中的应用，和此类TCR与治疗剂的融合体。

【技术实现步骤摘要】
T细胞受体本专利技术专利申请是国际申请号为PCT/GB2010/001277，国际申请日为2010年7月1日，进入中国国家阶段的申请号为“201080035140.2”，专利技术名称为“T细胞受体”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及结合YLEPGPVTA肽(衍生自gp100蛋白)的T细胞受体(TCR)，所述肽以肽-HLA-A2复合物呈递，相对于天然gp100TCRα和/或β可变域，所述TCR发生突变并且对所述复合物的结合亲和力和/或结合半衰期至少是参比gp100TCR的两倍。专利技术背景YLEPGPVTA(SEQIDNo:1)肽对应于人糖蛋白100(gp100)的氨基酸残基号280-288。Gp100在黑色素瘤癌细胞上广泛而显著地过量表达。例如，一项研究(Trefzer等.,(2006)MelanomaRes.16(2):137-45)发现28位黑色素瘤患者的192例黑色素瘤转移灶中有82％表达gp100。几项研究报道了黑色素瘤组织中gp100表达水平较高(Hofbauer等.,(2004)JImmunother.27(1):73-8,Barrow等.,(2006)ClinCancerRes.12:764-71)。YLEPGPVTA(SEQIDNo:1)肽由gp100+/HLA-A2癌细胞上的I类HLA分子呈递。(Salgaller等.,(1996)CancerRes56:4749-4757)。因此，YLEPGPVTAHLA-A2复合物提供本专利技术TCR能靶向的癌症标记物。例如，本专利技术TCR可用于将细胞毒性剂递送至癌细胞的目的，或可转化入T-细胞，从而使得它们能破坏呈递HLA复合物的肿瘤细胞，以便在称为过继性治疗的治疗过程中给予患者。然而，为前一目的，如果TCR具有较高的亲和力和/或较慢的解离速率，从而该TCR能长期驻留在所靶向的肿瘤细胞上，则是理想的。为后一目的，如果TCR对肽-HLA复合物相比于具有该复合物特异性的天然TCR具有较高的亲和力和/或较低的解离速率，但不如前一目的的亲和力那样高，则是理想的。亲和力的急剧增加与TCR基因-修饰的CD8T细胞中抗原特异性丧失相关，从而能导致这些TCR-转染CD8T细胞的非特异性激活，因此中等亲和力TCR是过继性治疗所优选的(参见Zhao等.,(2007)JImmunol.179:5845-54；Robbins等.,(2008)JImmunol.180:6116-31；还参见公布的WO2008/038002)。本专利技术提供此类TCR。采用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法描述TCR，将其与TCR序列的IMGT公开数据库相关联。天然α-β异源二聚TCR具有α链和β链。广义上，各链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架序列中的3个CDR(互补决定区)，其中一个是称为CDR3的超变区。根据框架、CDR1和CDR2序列以及部分确定的CDR3序列，α链可变(Vα)区可分成几类，β链可变(Vβ)区可分成几类。在IMGT命名法中，通过唯一的TRAV编号指代Vα类型。因此，“TRAV17”限定了具有独特框架及CDR1和CDR2序列和CDR3序列的TCRVα区，所述CDR3序列部分由TCR之间保守性的氨基酸序列确定，但其还包含TCR之间不同的氨基酸序列。“TRBV19”以相同方式限定了具有独特框架及CDR1和CDR2序列的TCRVβ区，但仅包含部分确定的CDR3序列。通过独特的IMGTTRAJ和TRBJ命名法类似地确定TCR的连接区，通过IMGTTRAC和TRBC命名法确定恒定区。IMGT命名法通过缩写TRBD指代β链多变区，如上所述，连锁的TRBD/TRBJ区常一起视作连接区。αβTCR的α和β链常视作各自具有两个“结构域”，即，可变域和恒定域。可变域由连锁的可变区和连接区构成。因此，在本申请的说明书和权利要求书中，术语“TCRα可变域”指连锁的TRAV和TRAJ区，术语TCRα恒定域指胞外TRAC区或C-末端截短的TRAC序列。类似地，术语“TCRβ可变域”指连锁的TRBV和TRBD/TRBJ区，术语TCRβ恒定域指胞外TRBC区或C-末端截短的TRBC序列。TCR领域的工作人员广为知晓并可得到IMGT命名法确定的独特序列。例如，可在IMGT公开数据库中找到。“《T细胞受体手册(TcellreceptorFactsbook)》”，(2001)，LeFranc和LeFranc，学术出版社(AcademicPress)，ISBN0-12-441352-8还公开了IMGT命名法确定的序列，但由于其公布日期和随后的时间滞后，有时需要参考IMGT数据库验证其中的信息。我们证实了天然gp100TCR克隆具有以下α链和β链V、J和C基因应用：α链-TRAV17/TRAJ29/TRAC(天然gp100TCRα链的胞外序列见SEQIDNo:2)。β链:-TRBV19*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2(天然gp100TCRβ链的胞外序列见SEQIDNo:3)。(注意：TRBV19序列具有3个等位基因变体，在IMGT命名法中分别称为TRBV19*01、*02和*03，上述天然gp100TCR克隆具有*01变异。同样，TRBJ2-7序列具有两个已知的变异，上述TCR克隆中存在的是*01序列。还应注意，缺乏”*”限定符表示相关序列仅已知一种等位基因。)术语“野生型TCR”、“天然TCR”、“野生型gp100TCR”和“天然gp100TCR”在文本同义使用，指代具有胞外α和β链SEQIDNo:2和3的该天然产生的TCR。
技术实现思路
本专利技术提供具有结合YLEPGPVTA(SEQIDNo:1)HLA-A2复合物特性的包含TCRα可变域和/或TCRβ可变域的T细胞受体(TCR)，其特征在于所述TCR(i)相对于具有胞外α和β链序列SEQIDNo：2和3的天然gp100TCR，在其α链可变域(SEQIDNo：2的氨基酸1-109)和/或其β链可变域(SEQIDNo：3的氨基酸1-112)中发生突变；和(ii)对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是参比gp100TCR的至少两倍，所述参比gp100TCR具有胞外α链序列SEQIDNo：45和胞外β链序列SEQIDNo：46。注意，SEQIDNo:45是天然α链胞外序列IDNo:2，除了C157取代了T157(即，TRAC的T48)和K113取代了N113。类似地，SEQIDNo:46是天然β链胞外序列IDNo:3，除了C169取代了S169(即，TRBC2的S57)，A187取代了C187，D201取代了N201。相比于天然α和β链胞外序列，这些半胱氨酸取代能形成稳定重折叠的可溶性TCR的链间二硫键，即，通过重折叠胞外α和β链形成的TCR。利用稳定的二硫键连接的可溶性TCR作为参比TCR能更方便地评估结合亲和力和结合半衰期。与天然α和β链SEQIDNo：2和3相比，α链SEQIDNo：45和β链SEQIDNo：46中的其它突变是“沉默突变”，意味着相对于天然序列，它们不影响结合亲和力或结合半衰期。因此，如果本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种T细胞受体(TCR)，其具有结合YLEPGPVTA(SEQ ID No:1)HLA‑A2复合物的特性，并具有：(a)序列如SEQ ID No:2的氨基酸1到109所示、但包含S1A、S1G、D94S、D94T、D94R、L97M、V98M、V98Q、V98G、V98S、V98A和G102D中一个或多个突变的α链可变域序列；和/或(b)序列如SEQ ID No:3的氨基酸1到112所示、但包含L27I、N28F、H29Q、D30K、A31K、Q50W、I51A、I51G、V52Q、V52Y、V52T、N53G、N53F、D54N、D54H、A61T、S94L、I95Y、I95H、I95W、I95F、I95S、I95V、G96C、G97E、G97A、P98G、E100Q和E100P中一个或多个突变的β链可变域序列，其中，所述TCR对YLEPGPVTA‑HLA‑A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是具有胞外α链序列SEQ ID No：45和胞外β链序列SEQ ID No：46的TCR的至少两倍。

【技术特征摘要】
2009.07.03 GB 0911566.81.一种T细胞受体(TCR)，其具有结合YLEPGPVTA(SEQIDNo:1)HLA-A2复合物的特性，其中，所述TCR的α链可变域序列和β链可变域序列选自如下所示的组合：α链可变域序列的SEQIDNo.β链可变域序列的SEQIDNo.2(氨基酸1-109)102(氨基酸1-109)132(氨基酸1-109)142(氨基酸1-109)162(氨基酸1-109)172(氨基酸1-109)182(氨基酸1-109)192(氨基酸1-109)202(氨基酸1-109)222(氨基酸1-109)232(氨基酸1-109)242(氨基酸1-109)262(氨基酸1-109)282(氨基酸1-109)292(氨基酸1-109)302(氨基酸1-109)312(氨基酸1-109)322(氨基酸1-109)332(氨基酸1-109)342(氨基酸1-109)3572082092082582682773(氨基酸1-112)83(氨基酸1-112)93(氨基酸1-112)其中，所述TCR对YLEPGPVTA-HLA-A2复合物的结合亲和力和/或结合半衰期是具有胞外α链序列SEQIDNo：45和胞外β链序列SEQIDNo：46的TCR的至少两倍。2.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR是αβ异源二聚TCR，其具有α和β链恒定域序列，其中半胱氨酸残基取代TRAC的Thr48和TRBC1或TRBC2的Ser57，所述半胱氨酸在所述TCR的α和β恒定域之间形成二硫键。3.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR是αβ异源二聚TCR，其具有α和β链恒定域序列，其中恒定域序列通过TRAC的外显子2的Cys4和TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键相连。4.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR与可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分或任何这些物质的组合结合。5.如权利要求4所述的TCR，其特征在于，所述治疗剂是共价连接于所述TCR的α或β链的C-或N-末端的抗-CD3抗体。6.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，与具有胞外α和β链序列SEQIDNo：2和3的TCR相比，所述TCR具有修饰的糖基化。7.一种多价TCR复合物，其包含至少两个以上权利要求中任一项所述的TCR。8.编码权利要求1到6中任一项所述TCR的...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·K·雅各布森，N·哈伍德，N·R·利迪，
申请(专利权)人：英美偌科有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB