牛分枝杆菌分子伴侣蛋白GroEL1及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种牛分枝杆菌分子伴侣蛋白GroEL1及其编码基因，属于生物和疫苗技术领域。申请人从牛分枝杆菌卡介苗基因组中克隆获得GroEL1基因，将该基因重组至耻垢分枝杆菌中表达，在确定了其高黏附及侵袭能力后，再将该基因在大肠杆菌中表达，最终获得重组蛋白GroEL1。该蛋白能提高机体的IgG、IgA抗体水平以及机体的Th2型细胞免疫水平，具有一定的抗牛分枝杆菌感染能力，在牛分枝杆菌致病机制研究、疫苗和诊断试剂研发中具有应用前景。

Molecular chaperone protein GroEL1 of Mycobacterium bovis and its coding gene and Application

【技术实现步骤摘要】
牛分枝杆菌分子伴侣蛋白GroEL1及其编码基因与应用
本专利技术属于生物和疫苗
，具体涉及一种牛分枝杆菌免疫相关的分子伴侣蛋白GroEL1，该蛋白具有高黏附能力和高侵袭能力，可以提高机体的IgG、IgA抗体水平以及Th2型细胞免疫水平，表明该蛋白能够引发高水平体液免疫和细胞免疫，具有一定的抗牛分枝杆菌感染能力，有作为牛结核病疫苗的潜能。
技术介绍
牛结核病是一种慢性消耗性人畜共患病，奶牛结核病被列为我国优先防治的动物病种之一。牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis)是引起牛结核病的主要病原，，同时也能够从牛传染给人及其它动物，给社会带来巨大的经济损失和产业损失。疫苗是动物疫病防控的最为重要且有效的手段之一。但由于奶牛为乳用动物，考虑到公共卫生因素，各国对牛结核病尤其是奶牛结核病的疫苗免疫格外谨慎。随着部分国家牛结核病防控形势的日趋严峻，越来越多的国家开始选择对牛进行疫苗免疫来预防结核病。卡介苗是在牛结核病免疫时优选的疫苗，但其免疫效果与预期还存在较大的差距。为有效防控牛结核病，疫苗研发越来越受到广泛关注。有效的疫苗靶标是研制高效疫苗的基础，寻找高免疫原性的蛋白是开发高效疫苗的重中之重。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种牛分枝杆菌免疫相关蛋白GroEL1，该蛋白是一类分子伴侣蛋白，具有提高机体免疫水平的能力。为了实现本专利技术的目的，申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室从牛分枝杆菌卡介苗中扩增到了GroEL1基因并在耻垢分枝杆菌中进行了克隆，经WesternBlot分析验证，该蛋白成功表达，细胞模型验证了该重组菌具有非常高的黏附和侵袭能力。进一步将GroEL1连接至原核表达载体中并在大肠杆菌中进行表达纯化，经WesternBlot分析验证，证实了该蛋白具有良好的免疫原性。将该纯化的重组蛋白GroEL1与佐剂混合后进行小鼠免疫，发现蛋白能够显著提高小鼠IgG、IgA抗体水平及Th2型细胞免疫反应水平，具有重要的抗牛分枝杆菌感染潜能，是研发新药和疫苗的重要潜在靶点。本专利技术所提供的牛分枝杆菌免疫相关的分子伴侣蛋白，名称为GroEL1蛋白，来源于牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)卡介苗，是如下1)或2)的蛋白质：1)由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将SEQIDNO:6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且由1)衍生的蛋白质。SEQIDNO:6由539个氨基酸残基组成。上述序列可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的GroEL1的编码基因可通过将SEQIDNO:5所示的自5′末端第1-1620位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。上述蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。GroEL1蛋白的编码基因具体可为如下1)-3)中任一项所述的基因：1)其核苷酸序列是SEQIDNO:5所示的序列；2)在严格条件下可与SEQIDNO:5限定的DNA序列杂交且编码上述GroEL1蛋白的DNA分子；3)与1)限定的基因具有90％以上的同源性，且编码上述GroEL1蛋白的DNA分子。所述3)中的基因，与1)或2)限定的基因最好有95％以上的同源性。SEQIDNO:5所示的序列由1620个碱基对组成，为GroEL1基因的开放阅读框架(ORF)，编码氨基酸序列是SEQIDNO:6所示的GroEL1蛋白。含有上述GroEL1蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的具体技术方案如下所述：申请人所用的牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株BCG【美国模式培养物保藏所(ATCC)：35734】为美国俄勒冈州立大学LuizBermudez教授馈赠。本专利技术的前期工作包括对保藏的牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株基因组的提取。本专利技术以牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株BCG全基因组为模板克隆GroEL1基因，并连接至pMV261载体中，构建了重组质粒pMV261-GroEL1，将该重组质粒转化到耻垢分枝杆菌中，得到重组耻垢分枝杆菌，命名为Ms-pMV-G1。WesternBlot结果证实了该蛋白成功表达并具有反应原性。黏附及侵袭能力的检测结果显示该重组耻垢分枝杆菌相较野生株具有高黏附及侵袭能力。进一步将克隆的GroEL1基因连接至pET-30a载体中，构建了重组质粒pET-30a-GroEL1，将该重组质粒转化大肠杆菌DH5α得到重组大肠杆菌菌株，命名为EscherichiacolipET-30a-GroEL1，于2019年5月7日送交位于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCM2019333。该菌株在IPTG诱导下，表达GroEL1基因编码的重组蛋白。WesternBlot结果验证了该重组蛋白的高免疫原性和反应原性。为验证该蛋白在体内的免疫学作用，将纯化的重组蛋白GroEL1与佐剂混合后进行小鼠免疫，结果显示，GroEL1蛋白能够诱发高水平的IgG、IgA抗体及Th2型细胞免疫，具有抵抗牛分枝杆菌，预防牛结核病的潜能。本专利技术所提供的GroEL1蛋白还可用于制备牛结核病诊断试剂盒，例如牛分枝杆菌IgG或IgA抗体酶联免疫检测试剂盒。本专利技术具有以下优点：1、本专利技术的GroEL1重组蛋白由牛分枝杆菌GroEL1基因编码，被专利技术人证实具有高黏附能力和侵袭能力。2、本专利技术的GroEL1重组蛋白已被专利技术人证实具有免疫原性。3、本专利技术的GroEL1重组蛋白已被专利技术人在小鼠体内证实能够引起机体产生高水平的IgA、IgG抗体。4、本专利技术的GroEL1重组蛋白已被专利技术人在小鼠体内证实能够引起机体产生高水平的Th2型细胞免疫。更详细的技术方案请参见《具体实施方式》。序列表说明：序列表SEQIDNO：1是扩增GroEL1基因片段的引物GroEL1-F1的序列，用于构建pMV261-GroEL1。序列表SEQIDNO：2是扩增GroEL1基因片段的引物GroEL1-R1的序列，用于构建pMV261-GroEL1。序列表SEQIDNO：3是扩增GroEL1基因片段的引物GroEL1-F2的序列，用于构建pET-30a-GroEL1。序列表SEQIDNO：4是扩增GroEL1基因片段的引物GroEL1-R2的序列，用于构建pET-30a-GroEL1。序列表SEQIDNO：5是GroEL1基因的核苷酸的序列，其长度为1620bp。序列表SEQIDNO：6是GroEL1蛋白的氨基酸序列，共由539个氨基酸组成。附图说明图1：是pMV216的质粒图谱。图2：是本专利技术构建的重组质粒pMV261-GroEL1的图谱。由pMV261质粒和GroEL1基因全长经过限制性内切酶消化后连接重组而成。图3：Westernblot验证Ms-pMV-G1中GroEL1的表达。泳道M：高分子质量蛋白质标准；泳道1：Ms-pMV-G1中GroEL1表达情况的检测；泳道2：耻垢分枝杆菌空菌对照。图4：是Ms-pMV-G1感染A549细胞后黏附及侵袭能力定量检测分析图。“***”表示P<0.001；A：黏附能力定量检测结果；B：侵袭能力定量检测结果。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牛分枝杆菌分子伴侣蛋白GroEL1，具有如序列表SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.牛分枝杆菌分子伴侣蛋白GroEL1，具有如序列表SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述牛分枝杆菌分子伴侣蛋白GroEL1的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因具有如序列表SEQIDNO:5所示的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。5.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。6.根据权利要求4所述的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖钰，郭爱珍，刘志盈，彭永崇，胡长敏，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42