一种牛结核病γ-干扰素ELISA检测用鸡尾酒刺激抗原制造技术

本发明专利技术提供一种鸡尾酒抗原，用作牛结核病γ干扰素ELISA试验第一步的刺激抗原。该鸡尾酒刺激抗原可以替代现有的牛型、禽型PPD刺激抗原，简化检测的步骤，而且还可以用于区分待检测的牛是否经过疫苗免疫或发生了自然感染。本发明专利技术所提供的鸡尾酒抗原，包含有ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和Rv3615c抗原，其中ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和Rv3615c抗原的质量比为2:2:1:1。本发明专利技术的鸡尾酒抗原用于制备牛结核病γ干扰素ELISA检测用的刺激抗原。本发明专利技术制备的鸡尾酒抗原无需同时使用牛型PPD和禽型PPD就可以排除非特异性分枝杆菌感染。使用本发明专利技术组合抗原的刺激上清中就会产生大量的γ‑干扰素，从而对疫苗免疫和野毒株自然感染进行鉴别诊断。

A Cocktail Stimulating Antigen for Detection of Bovine Tuberculosis IFN-gamma by ELISA

The invention provides a cocktail antigen, which is used as a stimulus antigen for the first step of bovine tuberculosis interferon gamma ELISA test. The cocktail stimulating antigen can replace the existing PPD stimulating antigen of cattle and poultry, simplify the detection steps, and can also be used to distinguish whether the cattle to be tested have been vaccinated or have natural infection. The cocktail antigen provided by the invention comprises ESAT6 antigen, CFP10 antigen, FixB antigen and Rv3615c antigen. The mass ratio of ESAT6 antigen, CFP10 antigen, FixB antigen and Rv3615c antigen is 2:2:1:1. The cocktail antigen of the invention is used for preparing stimulating antigen for ELISA detection of bovine tuberculosis interferon gamma. The cocktail antigen prepared by the invention can eliminate non-specific Mycobacterium infection without simultaneously using bovine PPD and poultry PPD. The stimulus supernatant of the combined antigen of the invention can produce a large amount of interferon gamma, so as to differentiate and diagnose vaccine immunity and natural infection of wild virus strains.

【技术实现步骤摘要】
一种牛结核病γ-干扰素ELISA检测用鸡尾酒刺激抗原
本专利技术属于动物疫病检测领域，具体涉及一种牛结核病γ-干扰素检测用鸡尾酒刺激抗原及其制备方法。
技术介绍
牛结核病是一种慢性消耗性的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(OIE)规定必须通报的动物疫病，在我国属二类动物传染病，对养牛业、食品安全与人类健康构成重大威胁。据统计，人结核中约有5％是由牛分枝杆菌引起。因此掌握我国牛结核现状、检疫淘汰感染牛具有重要的公共卫生意义。牛结核病的检疫目前可归为三类，细菌学检测、分子生物学检测和免疫学检测。细菌学检测和分子生物学检测方法的样品采集需要屠宰牛，不适于活畜检疫。由于分枝杆菌引起的机体免疫应答以细胞免疫为主，因此目前应用最广泛的免疫学检测方法是结核菌素皮内变态反应和牛结核病γ-干扰素ELISA检测技术。牛结核菌素皮内变态反应是我国的法定检疫方法，但操作繁琐，耗时较长，难以满足牛结核病大量检疫的需求。近年来牛结核病γ-干扰素ELISA检测技术的应用越来越广，现已被OIE批准为皮内变态反应的试验的替代试验。牛结核病γ-干扰素ELISA检测技术的第一步是制备刺激上清。其过程如下：①采血，采集牛的血液(至少5mL)放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。室温(22±5℃，避免温度过高或过低)下运送到实验室并在采血后8个小时内进行培养。②加样，将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加3孔，每孔1.5mL抗凝血。③加入刺激抗原，每头动物的3孔中，分别无菌加入100μL牛PPD、禽PPD作为刺激抗原，选用PBS作为阴性抗原对照。④孵育，将含有血液和抗原的组织培养板在37℃湿温培养箱中孵育16-24小时。⑤收样，用移液器小心吸取约400μL的上层血浆，转入独立的1.5mL离心管中作为刺激上清。牛结核病γ-干扰素ELISA检测技术的第二步是使用ELISA试剂盒检测已收获的刺激上清进行OD值检测，对其结果判定的标准如下：牛PPD的OD值－PBS的OD值≥0.1且牛PPD的OD值－禽PPD的OD值≥0.1为阳性；牛PPD的OD值－PBS的OD值<0.1或牛PPD的OD值－禽PPD的OD值<0.1为阴性。可见，目前牛结核病γ干扰素ELISA试验中的刺激抗原主要是牛型PPD、禽型PPD。这些刺激抗原的不足之处主要有如下2点。1、试验过程过于繁琐在制备刺激上清的过程中，既要使用牛型PPD进行刺激，也要应用禽型PPD进行刺激，制备过程过于繁琐。刺激试验完毕后，尚需同时收集牛型PPD和禽型PPD刺激上清。同时，进行ELISA试验时，也需同时检测牛型PPD刺激上清和禽型PPD刺激上清，并计算它们OD值的差值，进而判定结果。因此，现有的同时应用牛型PPD和禽型PPD作为刺激抗原制备刺激上清的试验，增加了试验步骤，浪费了更多的时间和精力，使试验过程过于繁琐。2、无法进行疫苗免疫株和野毒株自然感染的鉴别诊断牛型PPD是由牛结核分枝杆菌培养滤液制成，内含多种混合蛋白，这些蛋白不仅存在于野毒株中，也存在于疫苗株中，因此疫苗免疫后，采集全血使用牛型PPD刺激，能够产生大量的γ-干扰素，在ELISA检测中会呈阳性结果，这种阳性结果与野毒株自然感染的阳性结果是无法进行鉴别诊断的。因此，使用现有的牛型PPD刺激抗原无法进行疫苗免疫与自然感染鉴别的诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的鸡尾酒抗原，用作牛结核病γ干扰素ELISA试验第一步的刺激抗原。该鸡尾酒刺激抗原可以替代现有的牛型、禽型PPD刺激抗原，简化检测的步骤，而且还可以用于区分待检测的牛是否经过疫苗免疫或发生了自然感染。本专利技术所使用的鸡尾酒抗原，包含有ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和Rv3615c抗原，其中ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和Rv3615c抗原的质量比为2:2:1:1；上述的鸡尾酒抗原用于制备牛结核病γ干扰素ELISA检测用的刺激抗原,其中ESAT6抗原、CFP10抗原的浓度分别为20μg/mL；FixB抗原和Rv3615c抗原的浓度为10μg/mL。本专利技术的鸡尾酒抗原的优点如下：1、本专利技术的组合抗原简化了检测过程已有的方法在制备刺激上清的过程中，既要使用牛型PPD进行刺激，也要应用禽型PPD进行刺激来排除禽分枝杆菌等非特异性分枝杆菌引发的非特异性反应。本专利技术制备的鸡尾酒抗原无需同时使用牛型PPD和禽型PPD就可以排除非特异性分枝杆菌感染。由于简化了刺激试验的步骤和过程，相关的ELISA试验步骤也得到简化，从而使原有的牛结核病γ-干扰素ELISA试验得到了很大程度的简化。2、可以进行疫苗免疫和野毒株自然感染鉴别诊断本专利技术的组合抗原作为新型的刺激抗原，在使用卡介苗免疫动物后，采集全血使用进行刺激，刺激上清中并不能够产生的γ-干扰素；而对于野毒株感染的牛，使用本专利技术组合抗原的刺激上清中就会产生大量的γ-干扰素，从而对疫苗免疫和野毒株自然感染进行鉴别诊断。此前，由于没有相关的鉴别诊断刺激抗原，在临床上严禁对牛结核病进行免疫，本专利技术的应用，将使临床上进行牛结核病免疫成为可能，这是本专利技术在牛结核病防控领域取得的重大突破。附图说明图1：不同抗原的鉴别诊断效果图图2：不同抗原组合的鉴别诊断效果图图3：不同鸡尾酒抗原的鉴别诊断效果图图4：ESAT6浓度曲线图；图5：CFP10曲线图；图6：Rv3615c浓度曲线图；图7：FixB浓度曲线图；图8：鸡尾酒抗原和传统抗原的鉴别诊断比较图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术进行详细的描述。实施例1：鸡尾酒抗原的筛选过程1、抗原组分的筛选将ESAT6、CFP10、MPB83、FixB、Rv3615c稀释为终浓度1μg/mL的浓度，使用自然感染牛、卡介苗免疫牛、禽分枝杆菌感染牛和健康牛等4组动物进行试验，最终进行γ-干扰素ELISA检测，在5种抗原检测免疫动物和禽分枝杆菌感染动物的平均OD值几乎一致的情况下，ESAT6、CFP10检测自然感染动物平均OD值大于MPB83、FixB、Rv3615c的平均OD值。即ESAT6、CFP10作为鉴别诊断抗原时，其自然感染动物和疫苗免疫动物、非特异性感染动物的OD差值远大于其他抗原，表明ESAT6、CFP10的鉴别诊断效果优于其他组分(图1)。将ESAT6、CFP10作为必备组分，与将其他各组分进行组合，形成ESAT6/CFP10(简写为EC)、ESAT6/CFP10/MPB83(简写为ECM)、ESAT6/CFP10/FixB(简写为ECF)、ESAT6/CFP10/Rv3615c(简写为ECR)等4种组合，同时以PPDB/PPDA(简写为BA)作用传统方法对照。结果表明ESAT6/CFP10/Rv3615c组合优于其他组合(图2)。将ESAT6/CFP10/Rv3615c(简写为ECR)与其他分子进行组合，形成ESAT6/CFP10/Rv3615c(ECR)、ESAT6/CFP10/Rv3615c/MPB83(ECRM)、ESAT6/CFP10/Rv3615c/FixB(ECRF)、ESAT6/CFP10/Rv3615c/MPB83/FixB(ECRMF)等4种组合，检测结果表明ECRM、ECRF、ECRMF均优于ECR，但ECRM、ECRF、ECRMF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡尾酒抗原，其特征在于，所述的鸡尾酒抗原包含有ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和Rv3615c抗原，其中ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和Rv3615c抗原的质量比为2:2:1:1。

【技术特征摘要】
1.一种鸡尾酒抗原，其特征在于，所述的鸡尾酒抗原包含有ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和Rv3615c抗原，其中ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和Rv3615c抗原的质量比为2:2:1:1。2.权利要求1所述的鸡尾酒抗原在制备牛结核病γ干扰素ELISA检测用的刺激抗原中的应用。3.一种牛结核病γ干扰素ELISA检测用的刺激抗原，其特征在于，所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张喜悦，孙明军，孙翔翔，李阳，周晓翠，陈爽，魏荣，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东,37