结核分枝杆菌PKA蛋白及其融合蛋白在辅助诊断肺结核病中的应用制造技术

本发明专利技术公开了结核分枝杆菌PKA蛋白及其融合蛋白在辅助诊断肺结核病中的应用。本发明专利技术提供一种结核分枝杆菌蛋白质PKA及其与ESAT6融合表达而来的融合蛋白。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术获得的PKA蛋白和融合蛋白可以激活机体宿主细胞产生结核分枝杆菌抗原特异性IFN‑γ，候选为辅助诊断肺结核病的抗原，为提高肺结核病诊断的敏感性和特异性及开发新型诊断试剂盒提供新的思路。

Application of Mycobacterium tuberculosis PKA protein and its fusion protein in assistant diagnosis of pulmonary tuberculosis

The invention discloses the application of Mycobacterium tuberculosis PKA protein and its fusion protein in auxiliary diagnosis of pulmonary tuberculosis. The present invention provides a fusion protein of Mycobacterium tuberculosis protein PKA and ESAT6. The experiment of the invention proves that the PKA protein and the fusion protein obtained by the invention can activate host cells to produce Mycobacterium tuberculosis antigen-specific IFN_gamma, and the candidate is an antigen for auxiliary diagnosis of pulmonary tuberculosis, which provides a new idea for improving the sensitivity and specificity of diagnosis of pulmonary tuberculosis and developing a new diagnostic kit.

【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌PKA蛋白及其融合蛋白在辅助诊断肺结核病中的应用
本专利技术属于生物
，涉及活动性肺结核病(含菌阳、菌阴性肺结核病)患者的辅助诊断；尤其涉及一种结核分枝杆菌PKA蛋白及其融合蛋白在辅助诊断肺结核病的应用。
技术介绍
WHO发布的《2016年全球结核病报告》估算2015年全球新发结核病患者达1040万，约有180万人死于结核病。大量结核分枝杆菌潜伏感染者的存在也会导致未来结核病的发病率和患病率居于较高水平。近年来，由于流动人口的剧增、耐药结核分枝杆菌(DR-MTB)的出现及流行，以及人类免疫缺陷病毒(HIV)共感染，导致活动性结核病的发病率和死亡率大幅度上升,至今仍是一个不容忽视的世界性公共卫生难题。我国是结核病高负担国家之一,结核病的疫情严重，位居世界第二。在我国，结核病防控目前仍然面临以下问题：痰菌阳性结核病诊断方法敏感性和特异性低，临床诊断结核病病人中仅50％左右有病原学证据(痰涂片、痰培养和PCR检测)；而临床诊断结核病患者中占较大比例的痰菌阴性结核病(～50％)缺乏特异且敏感的诊断技术和方法，目前菌阴结核病的临床诊断仅靠X光检测或者实验性治疗，造成了临床误诊或者贻误患者合理治疗；耐药结核病诊断时间过长，耐多药结核病患者的负担越来越高；结核/非结核分枝杆菌混合感染鉴别诊断漏检率高；无法区别不同感染时期、无法早期诊断合并感染、无法客观地监测结核病疗效；缺乏有效保护成人结核病的预防性疫苗以及针对潜伏感染重点人群的干预治疗策略与措施等。其中，缺乏早期、快速的诊断技术和方法，缺乏菌阴结核病的诊断方法很大程度上导致了结核病患者的漏诊和社会播散、直接或间接增加了结核病的发病率和死亡率。从目前研究现状看，新疫苗和新药研制在短期内突破的可能性非常小。因此，如何尽快解决结核病诊断问题、早期诊断和治疗患者及研发新型疫苗是国际上的研究热点，是有效控制结核病发病率和死亡率最强有力的保证。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种结核分枝杆菌蛋白质。本专利技术提供的蛋白质，为如下a)-e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列1所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。编码上述蛋白的核酸分子也是本专利技术保护的范围。上述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：1)其编码序列包括序列表中序列3；2)其编码序列为序列表中序列3；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。本专利技术另一个目的是提供一种融合蛋白，包括上述蛋白和ESAT6蛋白。上述融合蛋白为如下1)-5)中任一种蛋白质：1)氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；2)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；3)将1)或2)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；4)与1)或2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；5)1)-4)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。编码上述融合蛋白的核酸分子也是本专利技术保护的范围。上述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：1)其编码序列包括序列表中序列4；2)其编码序列为序列表中序列4；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。上述的蛋白或上述融合蛋白在制备肺结核疫苗中的应用也是本专利技术保护的范围；或，上述的蛋白或上述融合蛋白在制备激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品中的应用；或上述的蛋白或上述融合蛋白在制备促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品中的应用；或上述的蛋白或上述融合蛋白在制备检测肺结核患者体内结核抗原/抗体产品中的应用；或上述的蛋白或上述融合蛋白在制备诊断或辅助诊断肺结核患者的产品中的应用。本专利技术第3个目的是提供一种产品。本专利技术提供的产品，其活性成分为权利要求1所述的蛋白或权利要求4或5所述融合蛋白；所述产品为如下1)-5)中任一种：1)肺结核疫苗；2)激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品；3)促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品；4)检测肺结核患者体内结核抗原/抗体产品；5)诊断或辅助诊断肺结核患者。上述中，所述肺结核患者为菌阳性肺结核患者或菌阴性肺结核患者。本专利技术的实验结果证明，本专利技术筛选了一种新型结核分枝杆菌PKA蛋白，其蛋白本身及其融合ESAT6得到的融合蛋白，可以刺激机体宿主细胞产生特异性IFN-γ，该蛋白可以为辅助诊断肺结核病提供依据。附图说明图1为结核分枝杆菌PKA蛋白表达及纯化的SDS-Page鉴定图；A图为PKA蛋白诱导表达结果图，B图为PKA蛋白纯化结果图。图2为融合蛋白(EP1.2)表达及纯化的SDS-Page鉴定图；A图为EP1.2诱导表达结果图，B图为EP1.2纯化结果图。图3为蛋白刺激宿主细胞IFN-γELISPOT检测结果(含正常人，菌阳、菌阴性肺结核病患者)。图4为蛋白刺激宿主细胞IFN-γELISPOT检测结果(含正常人，菌阳、菌阴性肺结核病患者)。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、PKA蛋白的获得1、表达载体及重组菌的构建PKA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1；编码蛋白PKA核酸的核苷酸序列为序列表中序列3。重组质粒pET30a-GST-PKA为将序列表中序列3所示的编码蛋白PKA核酸替换pET30a-GST载体(BPI,PT-00113)的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点间的DNA分子，得到的载体。将重组质粒pET30a-GST-PKA导入BL21菌中，得到重组菌。将空载体pET30a-GST转入BL21菌中，得到对照重组菌。2、目的蛋白的表达(1)接1μl活化的1得到的重组菌菌液到10mlLB液体培养基中，37℃培养，200rpm。(2)将培养的菌液转接到500mlLB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD＝0.6-0.8，IPTG(0.5mM)37℃诱导4h。(3)收菌：6,000rpm，离心5min。弃上清。(4)超声破菌：菌体用30ml10mMTris-HCl(pH8.0)溶液吹散，超声波破碎(500W,60次，每次10s，间隔15s)。(5)取100μl超声后的菌悬液，12,000rpm，离心10min，取50μl上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50μl10mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，为如下a)‑e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列1所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；e)a)‑d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，为如下a)-e)中任一种蛋白质：a)氨基酸序列包括序列表中序列1所示的氨基酸序列的蛋白质；b)氨基酸序列由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成；c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：1)其编码序列包括序列表中序列3；2)其编码序列为序列表中序列3；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。4.一种融合蛋白，包括权利要求1所述的蛋白和EST6蛋白。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为如下1)-5)中任一种蛋白质：1)氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；2)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；3)将1)或2)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；4)与1)或2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；5)1)-4)中任一所限定的蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘海鹰，宋辉，张艳，金奇，陈心春，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11