一种结核分枝杆菌延伸因子EF‑Tu蛋白的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种结核分枝杆菌延伸因子EF‑Tu蛋白的制备方法，属于重组蛋白的制备方法技术领域。所述的结核分枝杆菌EF‑Tu（

A preparation method of Mycobacterium tuberculosis Tu protein elongation factor EF

The invention relates to a preparation method of Mycobacterium tuberculosis EF elongation factor Tu protein, the recombinant protein preparation method belongs to the technical field. The EF of Mycobacterium tuberculosis Tu (

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法
本专利技术属于重组蛋白的制备方法
，具体涉及一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法。
技术介绍
EF-Tu蛋白是结核分枝杆菌反式翻译过程中重要的延伸因子，参与调控结核分枝杆菌在应激条件和正常的指数生长状态下的蛋白合成过程。EF-Tu蛋白作为分子开关调节蛋白合成的活性状态和非活性状态。在活性状态，EF-Tu与GTP结合，EF-Tu·GTP协助aa-tRNA准确结合至核糖体A位点，GTP水解为GDP，EF-Tu与GDP结合，即为非活性状态，EF-Tu·GDP从核糖体上释放，完成一轮的蛋白合成。近来研究发现，结核分枝杆菌EF-Tu（MtbEF-Tu）蛋白不仅是调控蛋白合成的关键因子，还在缺氧和高盐条件下大量产生、与结核分枝杆菌细胞壁相关（结核分枝杆菌易产生耐药性的关键因素是具有独特的细胞壁成分）、参与结合人的血纤维蛋白溶酶原，成功进入宿主。因此，MtbEF-Tu蛋白可以作为极具潜力的抗结核病药物靶标。结核分枝杆菌蛋白表达与纯化较为困难，进而阻碍了相关蛋白生化功能的研究进展。本专利技术涉及的MtbEF-Tu蛋白的表达与纯化方法为该蛋白结构生物学研究提供了前提条件，也为后续抗结核病新药研发奠定一定的基础。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种高表达且构象正确折叠的结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法。为此采用如下的技术方案：一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白，所述蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示。所述的蛋白质为如下1)-2)所示的蛋白质：1)氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-2所示组成的蛋白质；2)将SEQIDNO.1-2所示的氨基酸序列和/或核苷酸序列进行一个和或几个氨基酸/核苷酸序列的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质；一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，采用如下步骤：1)以来源于结核分枝杆菌（菌株类型：H37Rv）的延伸因子EF-Tu的全长编码基因为模板，利用PCR技术获得结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的全长编码序列，利用NdeI与HindIII限制性内切酶同时双酶切产物与载体pET-28a，利用T4DNA连接酶进行连接，获得连接产物；2)制备DH5α感受态细胞，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至公司进行基因测序，测序成功，获得pET-28a-MtbEF-Tu重组质粒;3)制备B834(DE3)感受态细胞，将2)获得的pET-28a-MtbEF-Tu重组质粒转化至B834(DE3)感受态细胞中，获得重组菌的单菌落；4)挑取单菌落于10mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基，在37℃条件下过夜培养，按照1：100的比列接入1L含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，培养至OD600nm值为0.6-0.8之间，然后加入终浓度为0.5mM的IPTG于25℃诱导8h，收集菌体；5)将上述菌体重悬于裂解缓冲液中（pH7.6，20mMTris-HCl，500mMNaCl，10mMMgCl2，10%甘油），超声破碎，离心，收集上清；6)将上清过滤后利用Ni-NTA柱亲和层析法纯化；7)将6)中获得的高纯度的MtbEF-Tu蛋白液置于浓缩管中浓缩，获得高浓度的MtbEF-Tu蛋白；8)利用圆二色谱技术（CD）测定步骤7)中获得MtbEF-Tu蛋白，实验结果表明：该重组蛋白的二级结构折叠较好，以β折叠为主。9)利用动态光散射技术（DLS）与核磁共振技术（NMR）测定步骤7)中获得MtbEF-Tu蛋白，实验结果表明：该重组蛋白在溶液中以单体形式存在，且折叠较好，具有很好的三级结构。连接产物和DH5α感受态细胞的体积比为1:4；重组质粒和B834(DE3)感受态细胞体积比为1:70。所述重组质粒pET-28a-MtbEF-Tu使用的酶切位点为NdeI与HindIII；MtbEF-Tu的基因片段长度为1188bp，编码396个氨基酸。本专利技术的优点在于：采用原核细胞B834(DE3)宿主菌诱导表达蛋白，能够稳定高效的表达结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白，且获得的蛋白具有纯度高，产量高，构象均一性好等特点。本专利技术所采用的结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法具有流程简便、周期短、成本低等优点。附图说明图1：琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果。（A）泳道M：DNAMarker；泳道1：PCR产物。图2：SDS-PAGE鉴定MtbEF-Tu蛋白诱导表达情况与纯化结果。（A）泳道M：蛋白Marker；泳道1：诱导前全菌；泳道2：诱导后全菌；泳道3：破碎后，离心上清；泳道4：破碎后，离心沉淀。（B）泳道M：蛋白Marker；泳道1：Ni-NTA柱亲和层析获得高纯度的MtbEF-Tu蛋白。图3：CD测定MtbEF-Tu蛋白二级结构折叠，实验结果表明：该蛋白在192nm呈现正峰，在218nm处有一个明显的负峰，说明MtbEF-Tu蛋白二级结构折叠较好，且主要以β折叠为主的构象存在。图4：DLS测定MtbEF-Tu蛋白在溶液中的寡聚状态，实验结果表明：该蛋白的直径在3nm左右，在溶液中以单体的形式存在。图5：NMR测定MtbEF-Tu蛋白的折叠情况，实验结果表明：该蛋白的1DH谱在6.5ppm-10.5ppm具有很宽的酰胺质子峰，表明该蛋白在溶液中具有较好的三级结构。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的具体实施方式进行详细的描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。除非另有其他明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并非排除其他元件或其他组成部分。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1具体采用如下步骤：1)取编码结核分枝杆菌EF-Tu蛋白的cDNA1μL，2×dNTP10μL，10×PCRbuffer2μL，PCRDNA聚合酶2μL，ddH2O2μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5μL混和均匀，对MtbEF-Tu基因进行PCR扩增，扩增条件为：95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s，共计循环35次；PCR扩增使用的上游引物为：5’ATTATTCCATATGGTGGCGAAGGCG3’（酶切位点：NdeI），下游引物为：5’GCGAAGCTTTCACTTGATGATCTTGG3’（酶切位点：HindIII）。PCR扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳（1%）对PCR产物进行鉴定，切取核苷酸片段大小为1200bp左右的片段，使用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化。对于纯化后的PCR产物利用双酶切反应进行双酶切：PCR产物15μL，限制性内切酶NdeI（Takara）1.5μL，限制性内切酶HindIII（Takara）1.5μL，10×BufferK（Takara）2μL，混匀，于37℃反应3h。对于载体pET-28a使用同样的双酶切步骤进行双酶切。对于双酶切后的PCR产物与载体分别使用PCR清洁试剂盒进行纯化，对于纯化后的产物进行连接，步骤为：双酶切本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核分枝杆菌延伸因子EF‑Tu蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸和核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸和核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示。2.权利要求1所述的一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：a)通过结核分枝杆菌EF-Tu基因的获取和克隆以及重组质粒pET-28a-MtbEF-Tu的构建；b)制备B834(DE3)感受态细胞，将a)获得的重组质粒转入该感受态细胞中，获得重组菌株；c)在25℃、200rpm、0.5mM异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）条件下诱导b)获得的重组菌株8h，获得MtbEF-Tu蛋白的大量上清表达；d)采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化c)获得MtbEF-Tu重组蛋白；最后利用浓缩管浓缩蛋白。3.根据权利要求2所述的一种结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：1)以结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu的全长编码基因为模板，利用PCR技术获得结核分枝杆菌延伸因子EF-Tu蛋白的全长编码序列，利用NdeI与HindIII限制性内切酶同时双酶切产物与载体pET-28a，利用T4DNA连接酶进行连接，获得连接产物；2)制备DH5α感受态细胞，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性克...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨娟娟，罗岭，孟春，洪晶，夏菁潞，赵晨，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35