The invention relates to an ESAT_6 protein of Mycobacterium bovis expressed by Bacillus subtilis and a preparation method thereof, belonging to the field of microorganisms. Aiming at the complicated problem of preparing ESAT_6 soluble protein of Mycobacterium bovis at present, the present invention inserts the ESAT_6 gene of Mycobacterium bovis into the pNC_HisE vector, obtains the ESAT_6_pNC_HisE expression vector, and transforms the ESAT_6_pNC_HisE expression vector into Bacillus subtilis, obtains the ESAT_6_pNC_HisE expression vector. Bacillus subtilis with positive expression vector was inoculated into LB medium and cultured in TM medium without induction. The supernatant was cultured at 33-37 C for 48-64 hours. The ESAT_ 6 protein was obtained after purification. The invention can be used for preparing ESAT 6 soluble protein.
【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白及其制备方法
本专利技术属于微生物领域,具体涉及一种牛分支杆菌ESAT-6蛋白及其制备方法。
技术介绍
早期分泌型蛋白ESAT-6是牛分支杆菌的主要免疫优势抗原,主要在牛分支杆菌感染早起分泌表达的一种抗原;卡介苗(BacillusCalmette-Guérin,BCG)是可用于防治结核病的减毒活疫苗,使用活的无毒牛型结核杆菌(Mycobacteriumbovis)制成,有足够高的免疫原性,可在一定程度上预防结核,但免疫动物后效果不稳定,动物机体接种BCG后会对皮内结核菌素反应的特异性产生严重干扰,因此用PPD皮试无法将疫苗接种与自然感染区分开来,但是卡介苗具有ESAT-6基因缺失,不能表达该蛋白,这一特征使其在牛分支杆菌导致的结核病早期诊断中有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术针对目前牛分支杆菌ESAT-6可溶性蛋白制备方法复杂的问题,提供了一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白及其制备方法。本专利技术所述的枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白是通过以下方法制备得到的:将牛分支杆菌ESAT-6基因,插入到pNC-HisE载体中,得到ESAT-6-pNC-HisE表达载体,并将ESAT-6-pNC-HisE表达载体转化入枯草芽孢杆菌中,得到含ESAT-6-pNC-HisE表达载体的阳性枯草芽孢杆菌,然后将上述阳性枯草芽孢杆菌单菌落经LB培养基培养后,接种到TM培养基,无需诱导,获得的菌液经纯化后得到融合表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白,所述牛分支杆菌ESAT-6基因序列如SEQIDNo.1 ...
【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT‑6蛋白,其特征在于,所述ESAT‑6蛋白是通过以下方法制备得到的:将牛分支杆菌ESAT‑6基因,插入到pNC‑HisE载体中,得到ESAT‑6‑pNC‑HisE表达载体,并将ESAT‑6‑pNC‑HisE表达载体转化入枯草芽孢杆菌中,得到含ESAT‑6‑pNC‑HisE表达载体的阳性枯草芽孢杆菌,然后将上述阳性枯草芽孢杆菌单菌落经LB培养基培养后,接种到TM培养基,无需诱导,获得的菌液经纯化后得到融合表达的牛分支杆菌ESAT‑6蛋白,所述牛分支杆菌ESAT‑6基因序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白,其特征在于,所述ESAT-6蛋白是通过以下方法制备得到的:将牛分支杆菌ESAT-6基因,插入到pNC-HisE载体中,得到ESAT-6-pNC-HisE表达载体,并将ESAT-6-pNC-HisE表达载体转化入枯草芽孢杆菌中,得到含ESAT-6-pNC-HisE表达载体的阳性枯草芽孢杆菌,然后将上述阳性枯草芽孢杆菌单菌落经LB培养基培养后,接种到TM培养基,无需诱导,获得的菌液经纯化后得到融合表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白,所述牛分支杆菌ESAT-6基因序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白,其特征在于,所述枯草芽孢杆菌在LB培养基中30~37℃培养至OD600=0.6~0.8,然后取菌液按1%的体积比例加入TM培养基,33~37℃培养48~64h,将菌液离心取上清,经纯化后获得融合表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白。3.根据权利要求1或2所述的一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白,其特征在于,所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilisRIK1285。4.一种权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:1)通过PCR方法获得牛分支杆菌ESAT-6基因序列,将其连接到pNC-HisE载体中,得到ESAT-6-pNC-HisE表达载体;所述牛分支杆菌ESAT-6基因序列如SEQIDNo.1所示;2)将ESAT-6-pNC-HisE表达载体转化入枯草芽孢杆菌中,在30~37℃培养16~20h后,得到含ESAT-6-pNC-HisE表达载体的阳性枯草芽孢杆菌;3)将含ESAT-6-pNC-HisE...
【专利技术属性】
技术研发人员:李海涛,苗利光,谷晨晨,刘艳环,张斌,
申请(专利权)人:中国农业科学院特产研究所,石家庄市兽用生物制品供应站,
类型:发明
国别省市:吉林,22
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