The methods of DNA extraction and recombinant vector construction of 38KD protein of Mycobacterium tuberculosis were as follows: amplification and identification of 38KD protein gene; construction of prokaryotic expression vector of MTB 38KD; expression and identification of MTB 38KD protein; purification of 8KD protein.
【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌38KD蛋白DNA提取、重组载体构建表达方法
本专利技术涉及结核分枝杆菌38KD蛋白DNA提取、重组载体构建、蛋白表达等原核功能表达方法及相应设备器材.属于病原菌蛋白DNA提取、重组载体构建、蛋白原核功能表达的
技术介绍
谈到结核,大家就闻之色变,这是为什么,首先来看一组数据。从世界卫生组织公布的情况来看,结核病已成为威胁人类健康的最严重疾病之一。我国是全球22个结核病高负担国家之一,我国约有5.5亿的人感染结核。由此可见,探寻结核病的感染机制尤为重要。结核分枝杆菌是结核病的病原菌,其为胞内寄生菌。当结核分支杆菌感染机体后,其疾病的发生、发展与机体的免疫应答状态有关。在此过程中,抗原提呈细胞起到了重要作用,它可通过识别结核分枝杆菌的多种成份,将抗原信息递呈给初始T细胞,引起以细胞免疫为主的抗结核免疫反应。而树突状细胞作为功能最强、唯一能激活初始T细胞的专职抗原提呈细胞作用尤为重要,已引起科学家的广泛关注。已有研究显示,MTB的抗原成分可通过影响树突状细胞的功能来调节机体的抗结核免疫反应。有趣的是:如Rv0315蛋白可促进树突状细胞的成熟而诱导抗结核免疫反应。ManLAM成分则可抑制树突状细胞的成熟而抑制抗结核免疫反应,使得MTB在体内长期存活。由于结核分枝杆菌成分的复杂性,其有众多的蛋白抗原,每种蛋白对树突状细胞的影响不同,38KD蛋白作为其中一种重要的蛋白成分,可引起机体的免疫反应!但未见到38KD蛋白和树突状细胞的相关研究报道;对树突状细胞会有什么影响,我们了解一下38KD蛋白。38KD蛋白是MTB复合群特异性膜脂蛋白,有7个抗原 ...
【技术保护点】
1.结核分枝杆菌38KD蛋白DNA提取、重组载体构建表达方法,其特征在于采用以下方法:1)将1 38KD蛋白cDNA的扩增与鉴定MTB基因组DNA提取:采用碱裂解法提取H37Rv基因组DNA,以提取的MTB‑DNA为模板,用MTB‑38KD Primer1 和 Primer2 为引物(5'端分别引入限制性内切酶BamH I和 Hind
【技术特征摘要】
1.结核分枝杆菌38KD蛋白DNA提取、重组载体构建表达方法,其特征在于采用以下方法:1)将138KD蛋白cDNA的扩增与鉴定MTB基因组DNA提取:采用碱裂解法提取H37Rv基因组DNA,以提取的MTB-DNA为模板,用MTB-38KDPrimer1和Primer2为引物(5'端分别引入限制性内切酶BamHI和Hind酶切位点),38KD上游引导物5’-CGCGGATCCATTCGTTTGCATACGCT,(下划线部分为BamHI酶切位点)Primer2:38KD下游引导物5'-CCCAAGCTTCTAGCTGGAAATCGTCGC,(下划线为Hind酶切位点)经过PAG纯化,每管OD值为1),用提取的目的基因为模板对目的片段进行PCR扩增;扩增条件:95℃预变性5min,95℃变性40s,58℃退火40s,72℃延伸50s,共30个循环;PCR反应体系体积为50μL,以2μL的H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增条件为:95℃预变性5min后,95℃变性40s,58℃退火40s,72℃延伸50s,30个循环后,再于72℃延伸10min结束扩增,PCR产物用纯化试剂盒进行纯化;取扩增产物3μL于20g/L琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像分析系统观察记录结果;2)MTB38KD原核表达载体的构建用BamHⅠ和HindⅢ双酶切质粒Pet28a和纯化后的PCR产物,分别纯化后将PCR产物与质粒载体Pet28a混合,T4连接酶进行连接,构建含有目的基因的重组质粒Pet28a-38KD,用CaCl2法转化宿主菌E.coliDH5α;以碱裂解法从阳性克隆提取质粒,进行双酶切鉴定并送测序;3)MTB38KD蛋白的表达与鉴定将构建好的重组质粒Pet28a-38KD转化到宿主菌BL21(DE3)中,挑单克隆接种于含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中,于37℃振荡培养过夜(A=0.4~0.6)...
【专利技术属性】
技术研发人员:袁建波,黎兵,向加林,胡姗姗,黄健,陈泽慧,闵迅,
申请(专利权)人:遵义医学院附属医院,
类型:发明
国别省市:贵州,52
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