一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用，属于细胞生物学领域。本发明专利技术发现了一种PknG的类红素氧还蛋白结果域，它可以通过与宿主泛素相互作用促进结核分枝杆菌的胞内存活过程同时促进肿瘤细胞的增殖。本发明专利技术可指导针对该结构域的抗结核分枝杆菌抗体开发以及现有结核疫苗改造。例如以该结构域为靶点的抑制剂或药物可以部分抑制结核分枝杆菌的胞内存活。此外，还可以将现有结核疫苗(如卡介苗)中的PknG基因中该结构域剔除掉，从而避免促癌风险，同时改造后的疫苗应用于临床肿瘤治疗时也会避免肿瘤发生等副作用。

【技术实现步骤摘要】
一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用
本专利技术涉及一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用。属于细胞生物学领域。
技术介绍
近年来，慢性炎症在癌症发生发展中的关键作用得到普遍认可，其促癌作用的机制已成为当前生命科学研究热点之一。研究表明，病毒或细菌感染引起的慢性炎症是导致肝癌、结肠癌或胃癌的最大危险因素之一。结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)引起的一种古老疾病，它至今仍是严重威胁全球人类健康的传染病之一。然而，结核分枝杆菌感染与肺癌发生或发展之间的相关性一直未有报道。
技术实现思路
本专利技术通过生物信息学分析预测发现Mtb分泌蛋白PknG中存在一个类红素氧还蛋白结构域，经研究，类红素氧还蛋白结构域与宿主的泛素蛋白相互作用激活PknG的自剪切功能，剪切后的PknG进入细胞核调控细胞增殖等细胞进程，并且在促进结核分枝杆菌胞内存活过程中发挥部分功能。类红素氧还蛋白结构域缺失的PknG丧失自剪切及调控细胞增殖等细胞进程的功能。因此PknG中的类红素氧还蛋白结构域可作为潜在的抗结核药物新靶点。以该结构域为靶点研究的抑制剂或药物可以有效的抑制结核分枝杆菌与宿主的相互作用，从而部分抑制结核分枝杆菌的胞内存活及结核分枝感染引起的肺癌的发生和发展。为解决现有技术存在的缺陷，本专利技术的第一个目的是提供一种类红素氧还蛋白结构域，其序列为(a)或(b)或(c)，其中，(a)SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸由(a)衍生的多肽或其类似物；(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。本专利技术的第二个目的是提供所述类红素氧还蛋白结构域在制备致病菌抑制剂方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述类红素氧还蛋白结构域位于PknG蛋白上。在本专利技术的一种实施方式中，所述类红素氧还蛋白结构域来源于结核分枝杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述致病菌包括但不限于结核分枝杆菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌。本专利技术的第三个目的是提供所述类红素氧还蛋白结构域在制备抗结核病药物方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是指，将SEQIDNO.1所示的类红素氧还蛋白结构域作为药物作用靶点，制备可与之靶向结合的药物。本专利技术的第四个目的是提供一种疫苗，所述疫苗含有敲除所述类红素氧还蛋白结构域的PknG蛋白。本专利技术还要求保护所述类红素氧还蛋白结构域在制备肿瘤细胞抑制剂方面的应用。有益效果：本专利技术提供了一种可作为潜在的抗结核药物的新靶点。以该结构域为靶点研究的抑制剂或药物可以有效的抑制结核分枝杆菌与宿主的相互作用，从而部分抑制结核分枝杆菌的胞内存活及结核分枝感染引起的肺癌的发生和发展。附图说明图1为PknG通过类红素氧还蛋白结构域与泛素互作的验证；其中，HA-Ub，带有HA标签的Ub；HA-Ub(I44A)，带有HA标签的第44位异亮氨酸突变为丙氨酸的泛素；PknG-GFP，带有GFP标签的野生型PknG；PknG(97-139)-GFP，带有GFP标签的类氧还红素蛋白结构域；PknG(140-234)-GFP，带有GFP的PknG类泛素结构域；图2为PknG通过与Ub互作激活自剪切功能的验证；其中；GFP，在293T细胞中转染了表达GFP的pEGFP-N1空载体；PknG-GFP，表达PknG的pEGFP-N1-PknG；PknG△97-139-GFP，为表达类泛素结构域缺失的PknG蛋白的pEGFP-N1-PknG△97-139；图3为PknG自剪切后进入细胞核方式验证；其中；PknG，PknG蛋白；PknGK181M，激酶活性缺失PknG蛋白；PknG△97-139，类泛素结构域缺失的PknG蛋白；图4为促进结核分枝杆菌胞内存活的结构域验证；其中；△PknG，敲除PknG的Mtb；△PknG:PknG，敲除PknG后再回补PknG序列的Mtb(PknG表达类似于野生株Mtb)；△PknG:PknGK181M，表达无激酶活性PknG的Mtb菌株；△PknG:PknG△97-139，表达类氧还红素蛋白结构域缺失PknG的Mtb菌株；△PknG:PknG△140-234，表达类泛素结构域缺失PknG的Mtb菌株；△PknG:PknG△TPR，表达TPR结构域缺失PknG的Mtb；图5为促进肿瘤细胞增殖及迁移的结构域验证；其中；WT-BCG，感染表达野生型PknG的Mtb；△PknG，感染PknG敲除的Mtb；△PknG：PknG，感染敲除PknG后回补PknG的Mtb；△PknG:PknG△97-139，表达类氧还红素蛋白结构域缺失PknG的Mtb菌株；图6为促进肿瘤细胞在裸鼠体内成瘤结构的验证；其中；WT-BCG，感染表达野生型PknG的Mtb；△PknG，感染PknG敲除的Mtb；△PknG：PknG，感染敲除PknG后回补PknG的Mtb；△PknG:PknG△97-139，表达类氧还红素蛋白结构域缺失PknG的Mtb菌株。具体实施方式实施例1结核分枝杆菌分泌蛋白PknG的类红素氧还蛋白结构域通过生物信息学分析，发现结核分枝杆菌存在一段与真核细胞中红素氧还蛋白结构域类似的一段结构域，我们命名为类红素氧还蛋白结构域。该结构域存在于结核分枝杆菌效应蛋白PknG氨基酸位点97-139位，可以与宿主泛素蛋白相互作用，促进肿瘤细胞的增殖迁移及结核分枝杆菌的胞内存活等过程，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。pknG基因的序列如GeneID:886397所示。实施例2PknG通过类红素氧还蛋白结构域与泛素互作将PknG全长基因、编码类红素氧还蛋白结构域(PknG蛋白氨基酸第97-139位)的基因及编码类泛素结构域(PknG蛋白氨基酸第140-234位)的基因分别构建到pEGFP-N1质粒上；将泛素(Ub，GInumber：6647297)及其突变体Ub(I44A)(Ub的I44位是Ub与其他蛋白进行非共价疏水相互作用的关键位点)分别构建到PCS2质粒上；用Lipofectamine2000(Invitrogen)将重组质粒转染到HEK293T细胞中；转染6小时后更换新鲜培养基；转染24小时后弃掉培养基，PBS洗涤细胞两遍，然后用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞；收取细胞裂解液至1.5ml离心管13000rpm离心5分钟；将上清转移到新的1.5ml离心管，分别加入20微升GFP-Nanoab-Agarose(唯纳抗)；4度旋转4小时后离心收集Beads，细胞裂解液洗涤3次；加入SDS-PAGE上样缓冲液；沸水加热10分钟后上样并WesternBlotting检测。通过上述免疫共沉淀实验发现，PknG类红素氧还蛋白结构域与Ub相互作用，而与Ub(I44A)无相互作用。说明PknG通过类红素氧还蛋白结构域(氨基酸位点：97-139)与泛素间形成疏水相互作用而互作(图1)。实施例3PknG通过与Ub互作激活自剪切功能将编码PknG全长基因、类红素氧还蛋白结构域缺失基因(PknG△97～139)分别构建到pEGFP-N1质粒上；用Lipofectamine2000(Invitrogen)将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种类红素氧还蛋白结构域，其特征在于，其序列为(a)或(b)或(c)，其中，(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸由(a)衍生的多肽或其类似物；(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。

【技术特征摘要】
1.一种类红素氧还蛋白结构域，其特征在于，其序列为(a)或(b)或(c)，其中，(a)SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸由(a)衍生的多肽或其类似物；(c)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85％以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。2.权利要求1所述的类红素氧还蛋白结构域在制备致病菌抑制剂方面的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述类红素氧还蛋白结构域位于PknG蛋白上。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述类红素氧还蛋白结构域来源于结核分枝杆菌。5.根据权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘翠华，汪静，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11