本发明专利技术提供一种用于牛结核病变态反应检测的鸡尾酒抗原，包含有ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和HSPX抗原；其中，ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和HSP抗原的质量比为2:2:1.5:1.5。本发明专利技术所提供的鸡尾酒抗原可用于制备牛结核病变态反应的检测抗原。本发明专利技术的鸡尾酒抗原可以替代比较变态反应使用的牛型PPD和禽型PPD，用本鸡尾酒抗原进行单一皮内变态反应，即可以达到比较变态反应的效果，将两点剪毛、测定皮厚、注射、72小时候再次返场测定皮厚、计算皮厚差等系列操作，简化成了单点操作且无需计算，整个检测过程更为简便。同时，可以排除禽型分枝杆菌等非特异性分枝杆菌感染，更为特异的诊断牛结核病。
A Cocktail Antigen for Detection of Allergic Reaction to Bovine Tuberculosis
The present invention provides a cocktail antigen for detection of bovine tuberculosis allergic reaction, including ESAT6 antigen, CFP10 antigen, FixB antigen and HSPX antigen, in which the mass ratio of ESAT6 antigen, CFP10 antigen, FixB antigen and HSP antigen is 2:2:1.5:1.5. The cocktail antigen provided by the invention can be used to prepare the detection antigen of bovine tuberculosis pathological reaction. The cocktail antigen of the invention can replace the cattle-type PPD and the poultry-type PPD used for comparing allergic reactions. By using the cocktail antigen to carry out a single intradermal allergic reaction, the effect of comparing allergic reactions can be achieved. A series of operations such as two-point shearing, skin thickness measurement, injection, re-entry at 72 hours, skin thickness measurement and skin thickness difference calculation can be simplified into a single point operation without calculation. The detection process is simpler. At the same time, non-specific Mycobacterium infections such as avian Mycobacterium can be excluded and bovine tuberculosis can be diagnosed more specifically.
【技术实现步骤摘要】
一种用于牛结核病变态反应检测的鸡尾酒抗原
本专利技术属于动物疫病检测
，具体涉及一种用于牛结核病变态反应检测的鸡尾酒抗原。
技术介绍
牛结核病是一种慢性消耗性的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(OIE)规定必须通报的动物疫病，在我国属二类动物传染病，对养牛业、食品安全与人类健康构成重大威胁。据统计，人结核中约有5％是由牛分枝杆菌引起，因此掌握我国牛结核现状、检疫淘汰感染病牛具有重要的公共卫生意义。牛结核病的检疫目前可归为如下三类：细菌学检测、分子生物学检测和免疫学检测。细菌学检测和分子生物学检测方法在样品采集过程中需要屠宰牛，不适于活畜检疫的要求。免疫学检测方法包括血清学检测和细胞免疫检测，由于分枝杆菌引起的机体免疫应答以细胞免疫为主，因此目前应用最广泛是结核菌素皮内变态反应检测方法。牛结核病结核菌素皮内变态反应的方法有两种，一种是单一皮内变态反应试验，包括如下的步骤：①术前处理：将牛只编号后在颈侧中部上三分之一处剪毛，用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录。②注射：不论大小牛只，在剪毛处皮内注射牛型PPD0.1mL。③观察反应：皮内注射后经72h(±4-6h)判定结果。④结果判定：注射部位皮厚差大于等于4mm为阳性，皮厚差大于2mm同时小于4mm为可疑；可疑动物应至少间隔42天后再进行检测，结果为阳性或可疑的，判为阳性。而比较变态反应与单一皮内变态反应方法类似，包括如下的步骤：①术前处理：将牛只编号后在颈两侧中部上三分之一处(或颈单侧相距15cm以上的两点)剪毛，用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录。②注射：不论大小牛只，分别在两个剪毛点处皮内注射牛型PPD0.1mL和禽型PPD0.1mL。③观察反应：皮内注射后经72h(±4-6h)判定结果。④结果判定，阳性：牛型PPD反应阳性，牛型皮厚比禽型皮厚厚4mm以上；可疑：牛型PPD阳性或可疑，牛型皮厚与禽型皮厚之差在1-4mm；阴性：牛型PPD反应阴性；或虽为牛型PPD阳性或可疑，但与禽型皮厚相等或小于禽型皮厚。比较变态反应由于额外使用了禽型PPD进行检测的，可以显著增加变态反应的特异性，可以更为精确的诊断牛结核病。但是由于比较变态反应过于繁琐，几乎很难推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于牛结核病变态反应检测的鸡尾酒抗原，可用于诊断牛结核病。本专利技术的鸡尾酒抗原可以区分禽型PPD、牛型PPD，并能排除禽型分枝杆菌等非特异性分枝杆菌感染的影响。本专利技术所使用的鸡尾酒抗原，包含有ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和HSPX抗原；其中，ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和HSP抗原的质量比为2:2:1.5:1.5。本专利技术所提供的鸡尾酒抗原可用于制备牛结核病变态反应的检测抗原。本专利技术再一个方面提供一种牛结核病变态反应的检测抗原，是由上述的鸡尾酒抗原制备的；一种牛结核病变态反应的检测抗原，其中ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和HSPX抗原的终浓度分别为40μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、30μg/mL。本专利技术再一个方面提供一种牛结核病变态反应诊断试剂，其中包含有上述的鸡尾酒抗原和/或检测抗原。本专利技术的鸡尾酒抗原可以替代比较变态反应使用的牛型PPD和禽型PPD，用本鸡尾酒抗原进行单一皮内变态反应，即可以达到比较变态反应的效果，将两点剪毛、测定皮厚、注射、72小时候再次返场测定皮厚、计算皮厚差等系列操作，简化成了单点操作且无需计算，整个检测过程更为简便。同时，可以排除禽型分枝杆菌等非特异性分枝杆菌感染，更为特异的诊断牛结核病。附图说明图1：不同抗原的鉴别诊断效果图图2：不同抗原组合的鉴别诊断效果图图3：ESAT6浓度曲线图；图4：CFP10曲线图；图5：FixB浓度曲线图；图6：HSPX浓度曲线图；图7：蛋白电泳图；图8：新型单点皮试和比较皮试的耗时比较图；图9：新型单点皮试与传统方法排除禽型分枝杆菌感染的比较图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术进行详细的描述。实施例1：变态反应用鸡尾酒抗原的筛选1、抗原组分的筛选将ESAT6、CFP10混合作为一种抗原称之为EC，其浓度按照单组分浓度标识。将EC、FixB、MPB83和HSPX四种抗原稀释为终浓度10μg/mL的浓度，使用自然感染牛、禽分枝杆菌感染牛和健康牛等3组动物进行变态反应皮肤试验。在四种抗原检测禽分枝杆菌感染动物和健康牛的平均皮厚差值几乎一致的情况下，EC抗原检测自然感染动物的平均皮厚差大于MPB83、FixB、HSPX抗原的平均皮厚差。即EC作为鉴别诊断抗原时，其自然感染动物和非特异性感染动物的皮厚差远大于其他抗原，表明EC的鉴别诊断效果优于其他组分(图1)。将EC作为必备组分，与将其他各组分进行组合，形成EC/FixB(简写为ECF)、EC/MPB83(简写为ECM)、EC/HSPX(简写为ECH)等3种组合，同时以PPDB/PPDA(简写为BA)作用传统方法对照。结果表明ECF和ECH组合优于ECP组合。将EC同时与FixB和HSPX组合，形成EC/FixB/HSPX(简写为ECFH)，并与ECF和ECH和BA比较。结果认为ECFH优于ECF和ECH。因此确定以ESAT6/CFP10/FixB/HSPX组合作为鸡尾酒抗原组分(图2)。2、4种抗原的浓度筛选将EC、FixB、HSPX3种抗原蛋白分别做梯度稀释为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL,冻干后重新稀释，分别作为变态反应皮肤试验抗原，使用自然感染牛、禽分枝杆菌感染牛和健康牛等3组动物进行试验。结果表明禽分枝杆菌感染牛和健康牛等2组动物在所有抗原浓度上升时，其OD值无明显变化。而自然感染牛，4种蛋白作为抗原时，其皮厚差均会随着蛋白的浓度上升而上升，即自然感染牛和其他2组牛之间的皮厚差差值会随着抗原浓度上升而加大，但EC在浓度达到40μg/mL后，其皮厚差不再明显上升(见图3-4)，FixB和HSPX在浓度达到30μg/mL后，其皮厚差不再明显上升(图5-6)，证明EC的最佳使用浓度40μg/mL，FixB和HSPX的最佳使用浓度为30μg/mL实施例2：根据确定的抗原组合和浓度制备本专利技术的鸡尾酒抗原一、制备方法(一)试验材料1.主要仪器恒温振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司脱色摇床：QILINBEIER公司稳流稳压电泳仪：北京君意仪器厂公司超声波细胞粉碎机：宁波新芝科技生物有限公司Trans-SD通用型半干转印电泳槽：北京凯元信瑞仪器有限公司制冰机：上海安亭科学仪器厂紫外可见分光光度计：SHIMADZU微量核酸蛋白测定仪：Nanodrop冷冻干燥仪：东芝2.重组质粒重组pET-28a-HSPX、pET-28a-FixB、pET-28a-ESAT6和pET-28a-CFP10均为专利技术人构建。3.主要试剂冰醋酸、异丙醇、吐温-20、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、考马斯亮蓝、苯甲基磺酰氟、异丙基硫代半乳糖苷、丙烯酰胺、甲叉-丙烯酰胺、过硫酸铵、聚乙二醇20000、PBS缓冲液等购自国药集团化学试剂有限公司，十二烷基硫酸钠、氯化钠、氯化钾、考马斯亮蓝、甲基磺酰氟(PMSF)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)等购自上海生工生物工程有限公司4、主要本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鸡尾酒抗原，其特征在于，所述的鸡尾酒抗原包含有ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和HSPX抗原；其中，ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和HSP抗原的质量比为2：2：1.5：1.5。
【技术特征摘要】
1.一种鸡尾酒抗原，其特征在于，所述的鸡尾酒抗原包含有ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和HSPX抗原；其中，ESAT6抗原、CFP10抗原、FixB抗原和HSP抗原的质量比为2：2：1.5：1.5。2.权利要求1所述的鸡尾酒抗原在制备牛结核病变态反应的检测抗原中的应用。3.一种牛结核病变态反应的检测抗原，其特征在于，所述的检测抗原是由权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：张喜悦，孙明军，李阳，孙翔翔，尼博，陈爽，魏荣，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东,37
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