用于确定抗体或配体结合和功能的测定法制造技术

本发明专利技术涉及使用能够自发整合到细胞膜中的脂质样化合物用于确定抗体或配体结合和功能的新的基于细胞的测定法。

A method for determining the binding and function of antibodies or ligands

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定抗体或配体结合和功能的测定法专利
本专利技术涉及使用能够自发整合到细胞膜中的脂质样(lipid-like)化合物用于确定抗体或配体结合和功能的新的基于细胞的测定法。
技术介绍
化学疗法直到现在仍是最常用的癌症治疗之一。此外，基于抗体的治疗在过去15年中演变，现在在恶性血液肿瘤和实体瘤的治疗中是化学疗法方法的有价值的组合或替代。与化学疗法不一样，抗体治疗靶向癌细胞上的特异性抗原，从而允许更定向的治疗，从而减少对健康组织的副作用。在开发基于抗体的治疗剂的过程中，需要多种测定来鉴定最好的候选治疗剂进入临床试验，最终上市。在第一个早期临床前阶段，必须产生抗体，并分析它们的靶标特异性，以及它们对靶标的亲和力和功能性。通常在设计为尽可能接近生理环境的多种基于细胞的测定中测试功能性，以鉴定最佳候选者来在进入临床试验之前在动物模型中测试。这些功能性测定通常用原代细胞、肿瘤细胞系或设计为在激活特异性途径时表达报道分子的报道细胞进行。结合特性可以用多种蛋白质-蛋白质相互作用测定分析，如基于FRET的方法、表面等离子体共振(SPR)、荧光激活细胞分选(FACS)或AlphaScreenTM。例如，TagLiteTM技术代表了确定结合的可靠手段，并且具有允许以稳健和高通量方式表征候选药物的益处。然而，该技术的两个主要缺点是仅可以使用经转染的细胞，并且必须修饰目标靶以包括标签，这导致产生标签-抗原融合蛋白。因此，仍然需要开发不依赖于修饰靶的结合测定法，并且清楚地导致更全面的设置，它尽可能地减少对靶-抗体结合的非特异性影响。而且，在抗体治疗分子开发过程的早期阶段设计允许评估结合和功能性的组合测定法会具有大的益处。本专利技术的专利技术人开发了一种新的测定法，其可适用于多种不同的细胞类型，以评估抗体与它们的靶的结合，且不用修饰所述靶。该创新的测定法包括脂质样化合物，所述脂质样化合物能够自发地整合到细胞膜中以标记靶细胞，特别地用于提供FRET供体标记。此外，本专利技术提供了将抗体和抗体样结构物(例如配体)的结合和功能性评估组合在相同小管(vial)中的新测定法。该新测定法可用于例如筛选或表征目的。该新测定法代表了用于早期筛选和表征抗体与天然未修饰的靶的结合并评估功能性的有价值的工具，这将允许在候选药物开发的早期阶段鉴定最佳的结合物。专利技术概述在一个实施方案中，提供了用于确定特异性结合靶抗原的抗体或配体的结合和功能的体外测定法，包括以下步骤：i)提供细胞，所述细胞a)在它们的表面表达靶抗原，和b)用脂质样化合物标记，ii)加入待测试的抗体或配体；和iii)通过确定能量转移来测量与靶抗原的结合，其中所述脂质样化合物提供能量供体，并且能量接纳体与待测试的抗体或与结合该第一抗体的第二抗体共价或非共价缀合。在一个实施方案中，脂质样化合物是不天然存在于细胞的细胞膜中的合成化合物。在一个实施方案中，脂质样化合物能够自发地整合到细胞膜中。在一个实施方案中，脂质样化合物包含能量供体。在一个实施方案中，脂质样化合物与能量供体共价或非共价缀合。在一个实施方案中，该能量供体和接纳体是荧光共振能量转移(FRET)能量供体和接纳体，且在步骤iii)中测定的能量转移是荧光共振能量转移(FRET)。在一个实施方案中，该FRET是时间分辨FRET。在一个实施方案中，该FRET能量供体是铽穴合物(cryptate)和/或该FRET能量接纳体是d2。在一个实施方案中，该能量供体和接纳体是生物发光能量转移(BRET)能量供体和接纳体，在步骤iii)中测定的能量转移是生物发光能量转移(BRET)。在一个实施方案中，该能量供体和接纳体是AlphaScreen接纳体珠和供体珠，在步骤iii)中测定的能量转移是接纳体珠内从单线态氧至二甲基噻吩(thioxene)衍生物的能量转移。在一个实施方案中，脂质样化合物选自合成的功能-间隔物-脂质构建体(FSL)、合成的功能-间隔物-甾醇构建体(FSS)和两亲性分子，如荧光亲脂性阳离子羰花青染料。在一个实施方案中，脂质样化合物是合成的功能-间隔物-脂质构建体(FSL)。在一个实施方案中，脂质样化合物是FSL-生物素(Sigma)，且能量供体是铽标记的链亲和素。在一个实施方案中，步骤i)中的细胞额外地包含c)在靶抗原的应答元件控制下的报道基因；且该测定法包括额外的步骤iv)通过将报道基因的表达水平与靶抗原活化或抑制的水平相关联来确定抗体或配体的功能性。在一个实施方案中，在同一个小管中测量抗体与靶抗原的结合和功能性。在一个实施方案中，该报道基因选自编码荧光蛋白质的基因或编码可以检测其催化活性的酶的基因。在一个实施方案中，该报道基因编码绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶。在一个实施方案中，该靶抗原是细胞表面受体。在一个实施方案中，步骤iii)和iv)顺次进行或同时进行。在一个实施方案中，该靶抗原和反应元件是NF-κB途径的部分。在一个实施方案中，该反应元件包含至少一个具有SEQIDNO:1、2、3、4或5的DNA序列的DNA重复。在一个实施方案中，该反应元件包含SEQIDNO6、7、8或9的DNA序列。在一个实施方案中，该测定法包括用包含靶抗原反应元件控制下的编码报道基因的DNA序列的表达载体转染细胞的预备步骤。附图简述图1.使用TagLite技术的比较数据。SNAP-受体X转染和供体荧光染料铽标记后细胞的转染效率测定及成活力测量。在615nm波长测量每孔10000个细胞的铽信号。比较了转染试剂Lipofectamine2000、LipofectamineLTX和XtremeGeneHP。图2.使用TagLite技术的比较数据。SNAP-受体X转染和供体荧光染料铽标记后HEKNFκB-Luc-GFP和HeLaNFκB-Luc细胞的LipofectamineLTX转染效率测定及成活力测量。在615nm波长测量每孔10000个细胞的铽信号。图3.使用TagLite技术的比较数据。抗体-I和抗体-II与表达受体X的HEKNFκB-Luc-GFP和HeLaNFκB-Luc细胞的Tag-间接结合测定法。抗体按2倍稀释系列从25nM稀释至0.05nM。使用浓度为150nM的d2标记第二抗体。用GraphPadPrism6.0通过非线性回归拟合结合曲线。图4.使用TagLite技术的比较数据。抗体-I与表达受体X的HEKNFκB-Luc-GFP细胞结合的间接Tag-结合测定法。抗体-I按2倍稀释系列从12.5nM稀释至0.025nM。使用浓度为150nM或75nM的d2标记第二抗体。用GraphPadPrism6.0通过非线性回归拟合结合曲线。图5.使用TagLite技术的比较数据。抗体-I、抗体-III和抗体-IV与表达受体X的HEKNFκB-Luc-GFP细胞的间接Tag-结合测定法。所有抗体按2倍稀释系列从20nM稀释至0.04nM。使用浓度为75nM的d2标记第二抗体。用GraphPadPrism6.0通过非线性回归拟合结合曲线。图6.使用TagLite技术的比较数据。抗体-III与表达受体X的HEKNFκB-Luc-GFP细胞的间接Tag-结合测定法。抗体以2倍稀释系列按从20nM至0.04nM的浓度稀释。使用浓度为75nM的d2标记第二抗体。比较室本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于确定特异性结合靶抗原的抗体或配体的结合的体外测定法，包括以下步骤：i)提供细胞，所述细胞a)在它们的表面表达靶抗原，和b)用脂质样化合物标记，ii)加入待测试的抗体或配体；和iii)通过确定能量转移来测量与靶抗原的结合，其中所述脂质样化合物提供能量供体，并且能量接纳体与待测试的抗体或与结合该第一抗体的第二抗体共价或非共价缀合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.21 EP 16205785.51.用于确定特异性结合靶抗原的抗体或配体的结合的体外测定法，包括以下步骤：i)提供细胞，所述细胞a)在它们的表面表达靶抗原，和b)用脂质样化合物标记，ii)加入待测试的抗体或配体；和iii)通过确定能量转移来测量与靶抗原的结合，其中所述脂质样化合物提供能量供体，并且能量接纳体与待测试的抗体或与结合该第一抗体的第二抗体共价或非共价缀合。2.根据权利要求1所述的测定法，其中脂质样化合物是不天然存在于细胞的细胞膜中的合成化合物。3.根据权利要求1或2所述的测定法，其中脂质样化合物能够自发地整合到细胞膜中。4.根据权利要求1至3中任一项所述的测定法，其中脂质样化合物包含能量供体。5.根据权利要求1至3中任一项所述的测定法，其中脂质样化合物与能量供体共价或非共价缀合。6.根据权利要求1至5中任一项所述的测定法，其中能量供体和接纳体是荧光共振能量转移(FRET)能量供体和接纳体，且在步骤iii)中测定的能量转移是荧光共振能量转移(FRET)。7.根据权利要求6所述的测定法，其中FRET是时间分辨FRET。8.根据权利要求1至5中任一项所述的测定法，其中能量供体和接纳体是生物发光能量转移(BRET)能量供体和接纳体，且在步骤iii)中测定的能量...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·布塞尔，S·格劳理查兹，V·斯坦哈特，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH