用于确定同时结合的基于细胞的FRET测定法制造技术

本文报道了测定双特异性抗体与第一和第二抗原同时结合的方法，包括以下步骤：a)将表达细胞膜结合的带FRET‑供体标签的第一抗原和带FRET‑接受体标签的第二抗原的细胞与双特异性抗体结合，和b)通过测定从FRET‑供体向FRET‑接受体的能量转移来测定双特异性抗体的同时结合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定同时结合的基于细胞的FRET测定法本文报道了用于测定双特异性抗体对其靶/抗原两者的同时结合的细胞FRET测定法。
技术介绍
抗体功能结合的测定是在药物开发中进行的常规测试。荧光共振能量转移(FRET)是在50多年前首次描述的物理现象。FRET基于从供体分子到接受体分子的无辐射能量转移。因此不需要两种分子的直接接触，即它是依赖于距离的能量转移。因此，FRET可以用来研究分子间的相互作用。在US2015/024410中，涉及用于测定抗体与存在于测量培养基中的细胞膜或完整细胞中表达的Fc受体的结合的体外方法，其包括以下步骤：(i)用一对FRET配偶体的第一成员直接或间接标记所述Fc受体，或者将预先直接用一对FRET配偶体的第一成员标记Fc受体的细胞膜或完整细胞引入培养基；(ii)将直接或间接地用所述一对FRET配偶体的第二成员标记的所述抗体添加到测量培养基上；(iii)测量FRET信号，由抗体与Fc受体结合表示FRET信号的存在。在US2010/190266中报道了测量抗体与抗原或抗原表位以及Fc受体或其片段两者的结合活性的方法，包括：将抗体与用一组能够进行荧光共振能量转移的供体和接受体中的一个成员标记的抗原或抗原表位以及用所述一组供体和接受体的另一个成员标记的Fc受体或其片段混合的步骤；用具有能够激发供体的波长的光照射所得混合物的步骤；以及测量所述混合物的荧光水平的步骤。在US2006/165685中报道了双特异性抗Erb-B抗体及其在肿瘤治疗中的用途。在US2015/0204847中报道了用于检测活细胞中蛋白质结构变化的高通量、高精度方法。在US2015/0090936中报道了大斯托克斯位移染料。在US2015/0044690中报道了FRET测量装置和FRET测量方法。
技术实现思路
本文报道了测定双特异性抗体与第一和第二抗原/靶同时结合的方法，包括以下步骤：a)将表达细胞膜结合的带FRET-供体标签的第一抗原/靶和带FRET-接受体标签的第二抗原/靶与双特异性抗体一起孵育，和b)通过测定从FRET-供体向FRET-接受体的能量转移来测定双特异性抗体的同时结合。在一个实施方案中，细胞膜结合的FRET-供体和细胞膜结合的FRET-接受体以N-至C-端方向包含：H2N-抗原/靶-FRET-供体/接受体-跨膜结构域-COOH，或H2N-FRET-供体/接受体-抗原/靶-跨膜结构域-COOH，或H2N-FRET-供体/接受体-跨膜结构域-抗原/靶-COOH。在一个实施方案中，FRET-供体和/或接受体分别是标签和FRET-供体-荧光染料或FRET-接受体-荧光染料的缀合物。在一个实施方案中，缀合物是非共价缀合物，并且FRET-供体-荧光染料和/或FRET-接受体-荧光染料是荧光染料缀合的抗体。在一个实施方案中，缀合物是共价缀合物，标签是酶并且FRET-供体-荧光染料和/或FRET-接受体-荧光染料是荧光染料标记的自杀酶底物。在一个实施方案中，i)FRET-供体或FRET-接受体是SNAP-标签和苄基鸟嘌呤的共价复合物，并且ii)FRET-接受体或FRET-供体是CLIP-标签和O2-苄基胞嘧啶的共价复合物，其中FRET-供体和FRET-接受体是不同的标签。在一个实施方案中，双特异性抗体包含特异性结合第一抗原/靶的一个或两个结合位点和特异性结合第二抗原/靶的一个或两个结合位点。本文报道的一个方面是用于确定双特异性抗体的以较高KD值特异性结合其抗原/靶的结合位点的结合相互作用(强度)的方法，其包含特异性结合第一抗原/靶的第一结合位点和特异性结合第二抗原/靶的第二结合位点，由此两个结合位点以结合亲和力至少10倍差异结合其各自抗原/靶，包括以下步骤：a)将表达细胞膜结合的带FRET-供体标签的第一抗原/靶和带FRET-接受体标签的第二抗原/靶与双特异性抗体一起孵育，并通过测定来自FRET-供体到FRET-接受体的能量转移来测定双特异性抗体的结合，b)在增加浓度的包含具有较低KD值的双特异性抗体的结合位点的单特异性抗体存在下重复步骤a)，和c)通过测定从FRET-供体向FRET-接受体的能量转移减少时的单特异性抗体的浓度来测定结合相互作用(强度)。在一个实施方案中，单特异性抗体是二价的。专利技术详细描述杵臼二聚化模块及其在抗体工程中的用途描述于CarterP.RidgwayJ.B.B.；PrestaL.G.:Immunotechnology，第2卷，第1期，1996年2月，第73-73(1)页。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下文献中给出：Kabat，EA等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)。如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统来编号，在此被称为“根据Kabat编号”。具体而言，Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)的Kabat编号系统(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL和KabatEU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1，铰链，CH2和CH3，在这种情况下其在本文中通过参考“根据KabatEU索引编号”而澄清)。I.定义如本文所用，术语“抗原”表示抗体结合位点所结合的化合物/部分。抗原可以是可以产生抗体的任何部分，即靶，例如肽、多肽、蛋白质、半抗原或小分子。如本文所用，术语“FRET”和“荧光共振能量转移”表示在两个生色团之间发生的非辐射能量转移过程。术语“生色团”表示包括吸收某些波长的光并与另一生色团的这种区域相互作用以便可用于FRET的区域的部分。适用于FRET测定的生色团是本领域技术人员已知的并且容易获得。在一个实施方案中，生色团可以是供体(也称为FRET-供体)。FRET-供体表示这样的分子，其将吸收能量然后随着时间重新发射至少一部分能量。在一个实施方案中，生色团可以是接受体(也称为FRET-接受体)。FRET-接受体表示将接受来自FRET-供体的无辐射能量，由此降低供体的发射强度和激发态寿命的分子。因此，只要FRET-供体和FRET-接受体在物理上位置足够接近(最通常在2.5-12nm内)，则两个FRET-部分一起发挥作用，并且在以合适的波长激发时，FRET-供体向FRET-接受体转移精确量的能量(与FRET-供体-FRET-接受体距离的负六次方成正比)。通过观察FRET-供体荧光强度或寿命的减少或者在某些情况下还有FRET-接受体作为荧光再次发射的能量，可以特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定双特异性抗体与第一和第二抗原同时结合的方法，包括以下步骤：a)将表达细胞膜结合的带FRET‑供体标签的第一抗原和细胞膜结合的带FRET‑接受体标签的第二抗原的细胞与双特异性抗体一起孵育，和b)通过测定从FRET‑供体向FRET‑接受体的能量转移来测定双特异性抗体的同时结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.02 EP 15188065.51.一种测定双特异性抗体与第一和第二抗原同时结合的方法，包括以下步骤：a)将表达细胞膜结合的带FRET-供体标签的第一抗原和细胞膜结合的带FRET-接受体标签的第二抗原的细胞与双特异性抗体一起孵育，和b)通过测定从FRET-供体向FRET-接受体的能量转移来测定双特异性抗体的同时结合。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞膜结合的FRET-供体和所述细胞膜结合的FRET-接受体在N-端至C-端方向上包含：H2N-抗原-FRET-供体/接受体-跨膜结构域-COOH3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述FRET-供体和/或接受体是标签分别和FRET-供体-荧光染料或FRET-接受体-荧光染料的缀合物。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述缀合物是非共价缀合物，并且所述FRET-供体-荧光染料和/或所述FRET-接受体-荧光染料是荧光染料缀合的抗体。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述缀合物是共价缀合物，所述标签是酶并且所述FRET-供体-荧光染料和/或所述FRET-接受体-荧光染料是荧光染料标记的自杀酶底物。6.根据权利要求1至5中任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·西伯尔，J·菲舍尔，G·弗尔蒂格，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH