本发明专利技术公开了一种肺炎链球菌PiuA蛋白片段及其制备方法。本发明专利技术通过体外重组表达，能获得较高量的PiuA蛋白片段，并且易于制备，成本较低，更适宜于蛋白疫苗的大量制备。另外，本发明专利技术在原子水平上解析了所表达蛋白片段的三维晶体结构，能够为未来的药物和疫苗的设计以及改造提供更为直观的依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学领域，特别涉及一种肺炎链球菌PiuA蛋白片段的制备。
技术介绍
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一种常见的高发病率、高致死率的致病菌，1881年首次由巴斯德及G. M. Sternberg分别在法国及美国从患者痰液中分离出。为革兰氏阳性菌，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。5% 10%正常人上呼吸道中携带此菌。有毒株是引起人类疾病的重要病原菌。在化脓性球菌中，肺炎链球菌的致病力仅次于金黄色葡萄球菌。肺炎球菌主要的致病物质是肺炎球菌溶血素及荚膜。荚膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型的依据。肺炎链球菌是一种条件致病菌，健康人群及动物均可携带，当机体抵抗力下降时，肺炎链球菌将透过黏膜防御体系，从黏附部位下行至肺部或者进入血液引起细菌性肺炎， 以及中耳炎、败血症、脑膜炎等疾病。目前，肺炎球菌疾病已成为全球一个重要的公共卫生问题，主要感染儿童、60岁以上的老人以及一些免疫易患人群。世界卫生组织估计全球每年有160万人死于各种肺炎球菌疾病，其中5岁以下儿童约100万。近些年来随着抗生素的大量使用，相继出现对青霉素、大环内酯类、喹诺酮类以及三代头孢菌素等抗生素耐药或多重耐药的肺炎链球菌株系，这给治疗带来了极大的挑战。虽然疫苗预防是一种有效控制肺炎链球菌感染的手段，但目前上市的多糖疫苗的普适性并不是很好。23价多糖疫苗不能诱导免疫系统不完善的低龄儿童和老人产生有效的保护性抗体应答，临床效果较差；7价、11价和13价等疫苗不仅价格昂贵，且血清型不够广泛，会导致未覆盖血清型肺炎链球菌的发病率增高。因此，新型疫苗的研制和推广应用对该防治肺炎链球菌具有重要意义。蛋白疫苗能诱导对儿童及老人等免疫力低下人群的保护，且血清型覆盖面广、特异性高、生产成本较低，因此目前被认为是最有发展潜力的一类疫苗。PiuA蛋白(Pneumococcal iron uptake A, PiuA),存在于肺炎链球菌细胞膜表面(iron uptake lipoproteins),是肺炎链球菌铁离子ABC转运系统的底物结合蛋白(见图I)。PiuA在所有的肺炎链球菌株中具有高度保守的氨基酸序列，它不仅能通过结合人体血红蛋白或者血红素，实现自身对铁的获取，而且是已经鉴定的一类重要的肺炎链球菌毒力因子和潜在的疫苗抗原。已报道在肺炎链球菌引起的败血急相病人体内能诱发产生覆盖范围较广的非血清依赖性的抗体的产生，而应答PiuA蛋白的抗体主要是IgGl (ImmunoglobulinGsubclassl)形式。而在HL-60细胞模型中，抗PiuA的兔源单克隆抗体确实能增强细胞对多种不同血清型肺炎链球菌补体依赖或者非依赖型的免疫调理作用，即能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用或者激活补体。另外，在小鼠研究模型中，直接将PiuA蛋白注入到小鼠体内(主动免疫)或者将抗PiuA蛋白的抗体注入小鼠体内(被动免疫)都能有效预防小鼠感染肺炎链球菌引起的全身性疾病。进一步的深入研究表明，小鼠的黏膜一旦对PiuA蛋白产生免疫，在血液和呼吸系统都能诱发特异的免疫应答反应，产生特异的抗体，并有效阻断肺炎链球菌从小鼠鼻部开始的感染。但在现有技术中，PiuA蛋白的可溶性表达量低，因此，限制了其在疫苗等产业上的应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题为针对目前现有技术中肺炎链球菌蛋白可溶性表达量低的缺点，提供了一种能够大量可溶性制备的肺炎链球菌PiuA蛋白片段。本专利技术通过生物信息学分析和体外部分酶解实验等多种手段找到PiuA蛋白A38到K321位氨基酸一段较为稳定蛋白片段，能在大肠杆菌表达系统中超量表达，其步骤主要 包括I)以肺炎链球菌的基因组DNA为模板，通过PCR的方法扩增PiuA蛋白第38到321位氨基酸所对应的112bp 966bp序列，所用引物如下5' -ACTCATATGGCTCCAACAGAGGTAACCA-3'5' -CCTGCGGCCGCTTATTTCAAAGCTTTTTGTA-3'；2)对现有载体pET28a进行改造；3)将扩增的片段插入到表达载体pET28a的改进版P28的NdeI和XhoI酶切位点之间并测序鉴定；4)将上述重组载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达；5)将表达后的细菌收集、破碎，离心取上清进行镍金属亲和层析和分子筛分离纯化。本专利技术对现有的pET28a表达载体进行了改造。改造的位点主要是在多克隆位点(MCS)中去除了 pET28a的Nco I和Hi s-Tag之间的6个碱基(编码2个丝氨酸)和Hi s-Tag与Nde I之间的编码Thrombin肠激酶酶切位点的27个碱基，并将Nde I到Not I之间的66个碱基替换成了 12个碱基，酶切位点由Nde I-Nhe I-T7 · Tag-BamHI-EcoR I-Sac I-HindIII-Not I改变成Nde I-Sfi I-Not I。质粒图谱见图2。去除和替换的序列如下I) Nco I 和 His-Tag 之间的 6 个碱基:5，-AGCAGC-3，；2) Hi s-Tag与Nde I之间的编码Thrombin肠激酶酶切位点的27个碱基5’-AGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGC-3，；3)Nde I到Not I之间的66个碱基5，-GCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGC-3’，替换成 12 个碱基5’ -GCCAAAAAGGCC-3’。本专利技术人将目的片段重组到pET28a表达载体的改进版P28中，利用IPTG诱导目标蛋白的表达。IPTG是β_半乳糖苷酶的活性诱导物质，广泛应用于原核细胞蛋白质表达中。本专利技术通过亲和层析和分子筛的方法对表达出的目标蛋白进行分离纯化。亲和层析是利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。它是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，达到分离目的。分子筛是具有网状结构的天然或人工合成的化学物质，如交联葡聚糖、沸石等，当作为层析介质时，可按分子大小对混合物进行分级分离。分子筛的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。根据蛋白分子量大小不同，经历凝胶颗粒的流程长短不同，即流动速度不同，流出柱子的时间也不同，用280nm全程监测时，会找到目的分子量的蛋白所对应的出峰时间或体积，收集对应分子量的蛋白即可达到分离纯化的目的。本专利技术通过对比在相同条件下制备的不同长度的PiuA蛋白的可溶性表达产量，证明了 PiuA蛋白A38到K321位氨基酸所表达的蛋白较其他片段有更高的可溶性表达。本专利技术通过差式扫描量热法(DSC)来测定所表达目标蛋白的热稳定性、变性温度 以及蛋白纯度。差示扫描量热法(DSC)是在程序控制温度下，测量输给物质和参比物的功率差与温度关系的一种技术。在溶液中，蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肺炎链球菌PiuA蛋白片段，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？No.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈宇星，周丛照，师伟伟，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：
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