快速且高敏感的细菌检测制造技术

用于使用代谢监测来检测细菌存活力和药物效果的改善的方法和相关装置。将由氧淬灭的荧光材料与目标细菌共定位，并且在共定位的位置处检测荧光信号。在一些实施方案中，荧光材料是与样品中的目标细菌混合的荧光纳米颗粒，并且使用离心、电泳、用抗体、磁力等修饰的微流路径来增强共定位。在一些其它实施方案中，荧光材料是细菌培养室中固定化的荧光膜或3‑D基质，并且依靠离心、电泳或微流路径将样品中的细菌聚集入存在荧光膜或3‑D基质的细菌培养室的固定化区域。具有金属核心的等离子体纳米颗粒和具有金属膜的等离子体膜可以用作荧光纳米颗粒和荧光膜。

Rapid and highly sensitive detection of bacteria

Methods and related devices for the use of metabolic monitoring to detect the improvement of bacterial viability and drug effects. The fluorescence materials which are quenched by oxygen are Co located with the target bacteria and the fluorescence signals are detected at the position of CO location. In some embodiments, fluorescent materials are fluorescent nanoparticles mixed with target bacteria in the sample, and the co location is enhanced by centrifugation, electrophoresis, and modified microfluidic pathways such as antibodies and magnetic force. In other embodiments, the fluorescent material is fluorescent membrane immobilized bacteria culture chamber or 3 D matrix, and by centrifugation, electrophoresis or micro flow path in the sample into the existing fluorescent film or bacterial aggregation 3 D matrix immobilized bacteria culture chamber area. Plasma nanoscale particles with metal core and plasma membrane with metal film can be used as fluorescent nanoparticles and fluorescent films.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】快速且高敏感的细菌检测专利技术背景专利
本专利技术涉及通过代谢监测的细菌检测，如细菌存活力和药物抗性，并且特别地，其涉及使用氧敏感性荧光材料的细菌检测和用于增强细菌和荧光材料共定位的方法。
技术介绍
使用微孔阵列和氧敏感性荧光膜的快速细菌检测技术描述于Ayyashetal.,Fastandinexpensivedetectionofbacterialviabilityanddrugresistancethroughmetabolicmonitoring,2014HealthInnovationsandPoint-of-CareTechnologiesConference(Seattle,WashingtonUSA)October8-10,2014(“Ayyashetal.2014”)。该技术中，包括细菌的孔内氧消耗导致荧光信号发射。该论文摘录呈现如下：[我们介绍]创新的检测方法以通过小型化和并行化快速准确地诊断细菌感染。该方法用数种形状(正方形，圆形)、直径(100-1000μm)和深度(≤100μm)的孔加以证明。在概念证明的形成中，我们使用大肠杆菌的实验室菌株作为模型病原体。荧光氧传感器(三(2,2’-联吡啶)二氯化钌六水合物)(RTDP)的整合允许我们监视作为细菌代谢量度的溶解氧浓度。微孔内细菌的检测时间可以快至几个小时(4-5小时)，其中浓度在102至108个细胞/mL之间变化。将合适的药物添加到肉汤中并通过荧光测量生长也探测药物抗性。本报告的用于孔微加工的方法是快速、经济、通用和简单的。(摘要)。该方法中，将样品置于具有对感兴趣的特定细菌特异性的生长培养基的室中。该液体培养基为感兴趣的特定细菌的生长提供特定条件，同时防止其他污染物种生长。将在氧存在下淬灭的荧光团溶解在培养基中。由于细菌是需氧的，它们在代谢过程中消耗培养基中存在的氧，并消耗周围环境中的氧，产生荧光。可以通过将合适的药物添加到肉汤并通过荧光测量其生长或缺乏来探测药物抗性。(Pp.22-23)。当在大体积下(1-10mL)完成该代谢监测时，它还花费长时间。然而如果将样品分割为数千个较小的体积，则一些孔将含有感兴趣的细菌，而其他孔将不含。分割过程会将细菌的局部浓度增加几个数量级。因此，存在于该小体积中的营养物质将被快速耗尽，并且可以更快地感测到该事件。这是我们对细菌的快速代谢监测后的工作原理。(P.23)。实验设置和程序。在典型的实验中，将样品与含有生长培养基(Luria-Bertani(LB)培养基)和氧敏感性荧光团(三(2,2’-联吡啶)二氯化钌六水合物，(RTDP-0.1mg/mL)的溶液混合，并分配到微阵列上。简单的滑动过程将样品分配到亲水性微孔中，而疏水顶表面将样品从顶部清洁地除去(图1中的步骤4,5)。接下来，使用玻璃载玻片(使用表面活性剂变得疏水)将微阵列加盖并在荧光显微镜下成像以测量荧光团的强度。(P.23)。Ayyash等人2014的图1的一部分在本申请的图1中再现。本申请的图1A示意性地示出了Ayyash等人2014描述的分割的示例，其增加细菌的局部浓度并且氧迅速耗尽。专利技术概述在Ayyash等人2014描述的检测技术中，由于在细菌消耗氧的位置和荧光膜之间存在距离，因此氧消耗不会导致通过荧光膜的立即荧光信号发射。本专利技术的实施方案提供了使用细菌和由氧淬灭的荧光材料的共定位的改善的、快速且高灵敏度的细菌检测方法。任选地，荧光材料对目标细菌具有亲和力。本专利技术的一个目标在于改善细菌的周转时间(turnaroundtime)。其可实现以高灵敏度的快速检测。本专利技术的附加特征和优点将在下面的描述中阐述，并且部分地将从描述中是明显的，或者可以通过本专利技术的实践来了解。本专利技术的目的和其他优点将通过书面说明书及其权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。为了实现这些和/或其他目的，如体现并且广泛描述，本专利技术提供了用于检测活细菌的方法，其包括：提供由氧淬灭的荧光材料；在细菌培养室的区域中将所述荧光材料与所述细菌共定位；让所述细菌生长；并且检测由共定位的区域中的所述荧光材料发射的荧光信号。荧光材料可以是荧光纳米颗粒或荧光膜，并且可以对细菌具有亲和力。可以使用离心、电泳、微流路径、磁场、3-D基质等实现共定位。另一方面，本专利技术提供了可用于细菌检测的材料，所述材料包括由氧淬灭的荧光分子，并且还对目标细菌具有亲和力。应当理解，上述一般描述和以下详细描述都是示例性和说明性的，并且旨在提供对所要求保护的本专利技术的进一步说明。附图简述图1和图1A示意性显示了使用微孔阵列和氧敏感性荧光膜的细菌检测方法。图2示意性显示了根据本专利技术的实施方案的细菌检测原理。图3A和图3B示意性显示了根据本专利技术实施方案的荧光纳米颗粒与细菌共定位的优点。图4A至图4D示意性显示了用于实现或增强根据本专利技术实施方案的荧光纳米颗粒与细菌共定位的机制。图5A至图5D示意性显示了用于实现或增强根据本专利技术实施方案的固定化的荧光纳米颗粒与目标细菌共定位的机制。图6A示意性显示了具有金属核心的荧光纳米颗粒的结构。图6B显示了通过使用具有金属核心的等离子体纳米颗粒的荧光信号增强。图7A至7D示意性显示了可应用于图4A的实施方案的改进的离心装置。专利技术详述本专利技术的实施方案提供了细菌检测方法，其将细菌与包括由氧淬灭的荧光分子的荧光材料共定位。在一些实施方案中，所述荧光材料还对目标细菌或细胞具有亲和力。由于氧敏感性荧光材料和细菌间的距离接近，细菌的氧消耗立即导致来自荧光材料的荧光信号发射。因此，实现了快速且高敏感性的细菌检测。图2示意性显示了根据本专利技术的实施方案的细菌检测原理。细菌检测方法使用包括由氧淬灭的荧光分子的荧光材料10。经由稍后更详细描述的共定位机制将荧光材料10与活细菌20共定位(步骤S1)。允许细菌20生长并消耗氧(步骤S2)，这从相邻的荧光材料10中剥夺氧；结果，荧光材料发射荧光信号。检测来自共定位位置的荧光信号(步骤S3)。可以将Ayyash等人2014中描述的用于检测荧光信号的设置用于步骤S3，或可以使用任何其他合适的设置。在一些实施方案中，荧光材料是混合在含有目标细菌的样品中的荧光纳米颗粒。荧光纳米颗粒可以由核心形成，所述核心用由氧猝灭的荧光分子涂覆。在一些实施方案中，荧光纳米颗粒对目标细菌具有亲和力。将含有目标细菌和荧光材料的样品导入细菌培养室，如微孔或微流体装置。图3A和3B示意性显示了将荧光纳米颗粒与细菌共定位的优点。图3A示意性显示了微孔31，其中荧光膜11涂敷在其底部上(如Ayyash等人2014所描述)，和微孔中含有目标细菌20的样品。图3B显示了根据本专利技术的实施方案的围绕样品中细菌20的荧光纳米颗粒12。由于纳米颗粒12可以围绕细菌20，从纳米颗粒中氧剥夺的机会增加，并因此与使用荧光膜的情况相比，荧光信号增强(图3A)。可以使用各种机制来增强荧光纳米颗粒12与目标细菌20的共定位，其中一些在下文参考图4A-4D描述。第一种共定位方法使用离心(图4A)。将含有目标细菌20和荧光纳米颗粒12的样品置于细菌培养室32(如离心管)中并且在离心机中旋转(未示出)。结果，通过离心力将细菌20和荧光纳米颗粒12两者聚集在离心管的底部区域32A中，在那里它们彼此极其靠近(本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测活细菌的方法，其包括：提供由氧淬灭的荧光材料；在细菌培养室的区域中将所述荧光材料与所述细菌共定位；让所述细菌生长；并且检测由共定位的区域中的所述荧光材料发射的荧光信号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.26 US 62/185,4731.用于检测活细菌的方法，其包括：提供由氧淬灭的荧光材料；在细菌培养室的区域中将所述荧光材料与所述细菌共定位；让所述细菌生长；并且检测由共定位的区域中的所述荧光材料发射的荧光信号。2.权利要求1的方法，其中所述荧光材料对所述细菌具有亲和力。3.权利要求1的方法，其中所述荧光材料包含荧光纳米颗粒。4.权利要求3的方法，其中每个荧光纳米颗粒包含：金属核心；所述金属核心外部的间隔层；和所述间隔层外部的荧光材料。5.权利要求4的方法，其中所述金属核心由金、银或铝制成。6.权利要求3的方法，其中共定位步骤包括下列一项或多项：(1)对含有所述细菌和所述荧光纳米颗粒的样品施加离心，(2)对含有所述细菌和所述荧光纳米颗粒的样品施加电泳，其中所述荧光纳米颗粒与所述细菌具有相同的迁移率(mobility)，(3)使含有所述细菌和所述荧光纳米颗粒的样品通过微流路径，其中用对所述细菌具有亲和力的材料修饰所述微流路径的表面，并且其中所述荧光纳米颗粒对所述细菌具有亲和力，和(4)对含有所述细菌和所述荧光纳米颗粒的样品施加磁场，其中所述荧光纳米颗粒具有顺磁性。7.权利要求1的方法，其中共定位步骤包括以下之一：(1)提供具有表面区...

【专利技术属性】
技术研发人员：山本法明，
申请(专利权)人：柯尼卡美能达美国研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US