用于测量肉毒杆菌神经毒素活性的体外和基于细胞的测定制造技术

本文公开了用于检测和表征神经毒素例如肉毒杆菌神经毒素(BoNT)或破伤风神经毒素的方法。本公开提供了用于在体外和体内确定神经毒素的效力和活性的方法。还公开了包含报告蛋白的N‑和C‑末端片段的多肽，所述片段通过包含神经毒素切割位点的接头来分开。神经毒素对接头的切割降低了报告蛋白的活性，从而表明神经毒素的活性。还公开了组合物和试剂盒，其包含：所公开的多肽、包含编码这些多肽的核苷酸序列的核酸和表达这些多肽的细胞。

In Vitro and Cell-based Measurement of Botulinum Neurotoxin Activity

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测量肉毒杆菌神经毒素活性的体外和基于细胞的测定相关申请的交叉引用本申请要求2016年10月20日提交的美国临时申请号62/410558的权益，其内容通过引用整体并入本文。序列表本说明书参考序列表(以电子方式以名为“0342941_0630_SL.TXT”的.txt文件形式提交)。这个.txt文件于2017年10月13日生成，大小为34,305字节。所述序列表的全部内容以引用的方式并入本文。
本文描述的技术涉及用于确定神经毒素(例如肉毒杆菌毒素)的活性的方法和组合物。
技术介绍
肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是一种由于生物恐怖主义问题以及治疗应用而受到关注的试剂。传统上，通过大剂量地向小鼠施用导致它们死亡的样品来进行BoNT的检测和表征。已经探索了可以用细胞或在体外进行的测定，但是受到缺乏灵敏度或特异性的影响，经常由于与临床样品的常见组分反应而引起阳性信号。
技术实现思路
本文描述了经开发用于检测和测量体外和体内BoNT活性的新测定法。该测定使用独特的单链多肽，其特征在于例如通过BoNT的底物来连接的分裂荧光素酶，所述BoNT的底物被工程化以用作BoNT活性的传感器。在BoNT存在下，接头区域被毒素切割，导致荧光素酶活性降低，这很容易检测到。在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其从N-末端到C-末端包含：a)报告蛋白的N-末端片段；b)包含神经毒素切割位点的接头；c)报告蛋白的C-末端片段；其中N-末端和C-末端片段共同包含功能性报告蛋白序列；并且其中接头在功能上连接N-末端片段和C-末端片段以产生功能性报告融合蛋白。在任何方面的一些实施方案中，报告蛋白是荧光素酶蛋白。在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)N-末端结构域，其包含与SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸1-159具有至少90％序列同一性的序列(N-nano1-159)；b)包含位于N-nano1-159的C-末端的神经毒素切割位点的接头；c)具有SEQIDNO：1荧光素酶的氨基酸160-170至少90％序列同一性的序列的C-末端结构域(C-nano160-170)，其位于接头的C-末端；其中接头在功能上连接N-nano1-159和C-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。在任何实施方案的一个方面，本文描述了单链多肽，其包含：a)N-末端结构域，其包含相对于SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸1-159具有少于10个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列(N-nano1-159)；b)包含位于N-nano1-159的C-末端的神经毒素切割位点的接头；c)相对于SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸160-170具有少于3个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列的C-末端结构域(C-nano160-170)，其位于接头的C-末端；其中接头在功能上连接N-nano1-159和C-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。在任何方面的一些实施方案中，N-末端结构域具有SEQIDNo：1的荧光素酶的氨基酸1-159的序列(N-nano1-159)并且C-末端结构域具有SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸160-170的序列(C-nano160-170)。在任何方面的一些实施方案中，神经毒素切割位点是肉毒芽孢梭菌神经毒素(BoNT)和/或破伤风神经毒素切割位点。在任何方面的一些实施方案中，接头还包含位于BoNT切割位点与N-末端片段或结构域之间、神经毒素切割位点与结构域的C-末端片段之间或其组合的一个或多个间隔区。在任何方面的一些实施方案中，接头还包含BoNT和/或破伤风神经毒素的受体的结合片段。在任何方面的一些实施方案中，结合片段位于N-末端片段或结构域与BoNT切割位点之间。在任何方面的一些实施方案中，接头还包含位于结合片段与BoNT切割位点之间的间隔区。在任何方面的一些实施方案中，至少一个间隔区由甘氨酸和丝氨酸组成。在任何方面的一些实施方案中，至少一个间隔区是5至15个氨基酸。在任何方面的一些实施方案中，至少一个间隔区选自SEQIDNO：4-9。在任何方面的一些实施方案中，BoNT是A、E、C、B、D、F或G。在任何方面的一些实施方案中，BoNT切割位点来自SNARE蛋白。在任何方面的一些实施方案中，SNARE蛋白是SNAP-25、突触小泡蛋白(VAMP)或突触融合蛋白。在任何方面的一些实施方案中，BoNT切割位点是人SNAP-25b的氨基酸141-206。在任何方面的一些实施方案中，BoNT切割位点是人VAMP1的氨基酸35-96。在任何方面的一些实施方案中，受体是人SV2C。在任何方面的一些实施方案中，结合片段是人SV2C的氨基酸529-566，或与人SV2C的氨基酸529-566具有至少90％同一性的序列，或相对于人SV2C的氨基酸529-566，具有不超过10个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列。在任何方面的一些实施方案中，多肽还包含多组氨酸亲和标签。在任何方面的一些实施方案中，多组氨酸亲和标签位于多肽的C-末端。在任何方面的一些实施方案中，接头还包含位于N-末端片段或结构域与BoNT切割位点之间的完整第二荧光素酶多肽。在任何方面的一些实施方案中，第二荧光素酶多肽是萤火虫荧光素酶(例如，北美萤火虫(Photinuspyralis))，细菌荧光素酶(例如，费氏弧菌(Vibriofischeri)，哈维氏弧菌(Vibrioharveyi))，海肾萤光素酶(海洋腔肠(Renillareniformis))，甲藻萤光素酶，长腹水蚤(Gaussia)荧光素酶或桡足类荧光素酶。在任何方面的一些实施方案中，接头还包含位于第二荧光素酶多肽与BoNT切割位点之间的间隔区。在任何方面的一些实施方案中，间隔区为5至15个氨基酸。在任何方面的一些实施方案中，间隔区是GSSGGGGSGGGGSSG(SEQIDNO：4)，GSSGGGGSGGGSSG(SEQIDNO：5)或GGGGS(SEQIDNO：6)。在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸1-159(N-nano1-159)；b)位于N-nano1-159C-末端的接头，其包含：i)第一个5至15个氨基酸的间隔区；ii)位于第一个间隔区C-末端的由SV2C的氨基酸529-566组成的结合片段；iii)位于结合片段C-末端的第二个间隔区；iv)位于第二间隔区C-末端的BoNT切割位点，其包含人SNAP25b的氨基酸141-206；v)位于BoNT切割位点的C-末端的5至15个氨基酸的第三个间隔区；c)位于接头的C-末端的SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸160-170(C-nano160-170)；其中接头在功能上连接N-nano1-159和C-nano160-170产生功能性荧光素酶融合蛋白。在任何实施方案的一个方面，本文描述的是单链多肽，其包含：a)SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸1-159(N-nano1-159)；b)位于N-nano1-159C-末端的接头，其包含：i)5至15个氨基酸的第一间隔区；ii)位于第一间隔区C-末端的BoNT切割位点，其包含人SNAP25b的氨基酸141-206；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单链多肽，其从N‑末端到C‑末端包含：a.报告蛋白的N‑末端片段；b.包含神经毒素切割位点的接头；和c.所述报告蛋白的C‑末端片段；其中所述N‑末端和C‑末端片段共同包含功能性报告蛋白序列；并且其中所述接头在功能上连接所述N‑末端片段和C‑末端片段以产生功能性报告融合蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.20 US 62/410,5581.一种单链多肽，其从N-末端到C-末端包含：a.报告蛋白的N-末端片段；b.包含神经毒素切割位点的接头；和c.所述报告蛋白的C-末端片段；其中所述N-末端和C-末端片段共同包含功能性报告蛋白序列；并且其中所述接头在功能上连接所述N-末端片段和C-末端片段以产生功能性报告融合蛋白。2.如权利要求1所述的单链多肽，其中所述报告蛋白是荧光素酶蛋白。3.一种单链多肽，其包含：a.N-末端结构域，其包含与SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸1-159具有至少90％列同一性的序列(N-nano1-159)；b.位于N-nano1-159的C-末端的接头，其包含神经毒素切割位点；和c.位于所述接头的C-末端的C-末端结构域，其具有与SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸160-170至少90％序列同一性的序列(C-nano160-170)；其中所述接头在功能上连接所述N-nano1-159和所述C-nano160-170以产生功能性荧光素酶融合蛋白。4.一种单链多肽，其包含：a.N-末端结构域，其包含相对于SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸1-159具有少于10个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列(N-nano1-159)；b.位于N-nano1-159的C-末端的接头，其包含神经毒素切割位点；和c.位于所述接头的C-末端的C-末端结构域，其相对于SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸160-170，具有少于3个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列(C-nano160-170)；其中所述接头在功能上连接所述N-nano1-159和所述C-nano160-170以产生功能性荧光素酶融合蛋白。5.如权利要求3-4中任一项所述的单链多肽，其中所述N-末端结构域具有SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸1-159的序列(N-nano1-159)并且所述C-末端结构域具有SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸160-170的序列(C-nano160-170)。6.如权利要求1-5中任一项所述的单链多肽，其中所述神经毒素切割位点是肉毒芽孢梭菌神经毒素(BoNT)和/或破伤风神经毒素切割位点。7.如权利要求1-6中任一项所述的单链多肽，其中所述接头还包含位于所述BoNT切割位点与所述N-末端片段或结构域之间，位于所述神经毒素切割位点与所述C-末端片段或结构域之间，或其组合的一个或多个间隔区。8.如权利要求1-7中任一项所述的单链多肽，其中所述接头还包含BoNT和/或破伤风神经毒素的受体的结合片段。9.如权利要求8所述的单链多肽，其中所述结合片段位于所述N-末端片段或结构域与所述BoNT切割位点之间。10.如权利要求8-9中任一项所述的单链多肽，其中所述接头还包含位于所述结合片段与所述BoNT切割位点之间的间隔区。11.如权利要求1-10中任一项所述的单链多肽，其中至少一个间隔区由甘氨酸和丝氨酸组成。12.如权利要求1-11中任一项所述的单链多肽，其中至少一个间隔区是5至15个氨基酸。13.如权利要求1-12中任一项所述的单链多肽，其中至少一个间隔区选自SEQIDNO：4-9。14.如权利要求6-13中任一项所述的单链多肽，其中所述BoNT是A、E、C、B、D、F或G。15.如权利要求6-14中任一项所述的单链多肽，其中所述BoNT切割位点来自SNARE蛋白。16.如权利要求15所述的单链多肽，其中所述SNARE蛋白是SNAP-25、突触小泡蛋白(VAMP)或突触融合蛋白。17.如权利要求6-16中任一项所述的单链多肽，其中所述BoNT切割位点是人SNAP-25b的氨基酸141-206。18.如权利要求6-16中任一项所述的单链多肽，其中所述BoNT切割位点是人VAMP1的氨基酸35-96。19.如权利要求8-17中任一项所述的单链多肽，其中所述受体是人SV2C。20.如权利要求19所述的单链多肽，其中所述结合片段是人SV2C的氨基酸529-566，或与人SV2C的氨基酸529-566具有至少90％同一性的序列，或相对于人SV2C的氨基酸529-566，具有不超过10个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列。21.如权利要求1-20中任一项所述的单链多肽，还包含多组氨酸亲和标签。22.如权利要求21所述的单链多肽，其中所述多组氨酸亲和标签位于所述多肽的C-末端。23.如权利要求1-22中任一项所述的单链多肽，其中所述接头还包含位于所述N-末端片段或结构域与所述BoNT切割位点之间的完整第二荧光素酶多肽。24.如权利要求23所述的单链多肽，其中所述第二荧光素酶多肽是萤火虫荧光素酶(例如，北美萤火虫)，细菌荧光素酶(例如，费氏弧菌，哈维氏弧菌)，海肾萤光素酶(海洋腔肠)，甲藻萤光素酶，长腹水蚤荧光素酶或桡足类荧光素酶。25.如权利要求23或24所述的单链多肽，其中所述接头还包含位于所述第二荧光素酶多肽与所述BoNT切割位点之间的间隔区。26.如权利要求25所述的单链多肽，其中所述间隔区为5至15个氨基酸。27.如权利要求25或26所述的单链多肽，其中所述间隔区是GSSGGGGSGGGGSSG(SEQIDNO：4)，GSSGGGGSGGGSSG(SEQIDNO：5)或GGGGS(SEQIDNO：6)。28.一种单链多肽，其包含：a.SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸1-159(N-nano1-159)；b.位于N-nano1-159的C-末端的接头，其包括：i.5至15个氨基酸的第一间隔区；ii.位于所述第一间隔区的C-末端的结合片段，其由SV2C的氨基酸529-566组成；iii.位于所述结合片段的C-末端的第二间隔区；iv.位于所述第二间隔区的C-末端的BoNT切割位点，其包含人SNAP25b的氨基酸141-206；v.5至15个氨基酸的第三间隔区，其位于所述BoNT切割位点的C-末端；和c.SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸160-170(C-nano160-170)，其位于所述接头的C-末端；其中所述接头在功能上连接所述N-nano1-159和所述C-nano160-170以产生功能性荧光素酶融合蛋白。29.一种单链多肽，其包含：a.SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸1-159(N-nano1-159)；b.位于N-nano1-159的C-末端的接头，其包括：i.5至15个氨基酸的第一间隔区；ii.位于所述第一间隔区的C-末端的BoNT切割位点，其包含人SNAP25b的氨基酸141-206；iii.5至15个氨基酸的第二间隔区，其位于所述BoNT切割位点的C-末端；和c.SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸160-170(C-nano160-170)，其位于所述接头的C-末端；其中所述接头在功能上连接所述N-nano1-159和所述C-nano160-170以产生功能性荧光素酶融合蛋白。30.一种单链多肽，其包含：a.SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸1-159(N-nano1-159)；b.位于N-nano1-159的C-末端的接头，其包括：i.5至15个氨基酸的第一间隔区；ii.位于所述第一间隔区的C-末端的BoNT切割位点，其包含人VAMP1的氨基酸35-96；iii.5至15个氨基酸的第二间隔区，其位于所述BoNT切割位点的C-末端；和c.SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸160-170(C-nano160-170)，其位于所述接头的C-末端；其中所述接头在功能上连接所述N-nano1-159和所述C-nano160-170以产生功能性荧光素酶融合蛋白。31.一种单链多肽，其包含：a.SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸1-159(N-nano1-159)；b.位于N-nano1-159的C-末端的接头，其包括：i.第二功能性荧光素酶多肽；ii.5至15个氨基酸的第一间隔区，其位于所述第二荧光素酶多肽的C-末端；iii.位于所述第一间隔区的C-末端的BoNT切割位点，其包含人SNAP25b的氨基酸1-206；iv.5至15个氨基酸的第二间隔区，其位于所述BoNT切割位点的C-末端；和c.SEQIDNO：1的荧光素酶的氨基酸160-170(C-nano16...

【专利技术属性】
技术研发人员：董民，于非凡，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，
类型：发明
国别省市：美国,US