使用经掩蔽的半抗原在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中的蛋白邻近测定法制造技术

本文中公开了经掩蔽的半抗原和经掩蔽的半抗原‑抗体缀合物，其可用于实现样品中位于彼此附近的靶标的检测。

Protein proximity assay using masked hapten in formalin-fixed paraffin-embedded tissues

In this paper, masked hapten and masked hapten antibody conjugates are disclosed, which can be used to detect targets near each other in samples.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用经掩蔽的半抗原在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中的蛋白邻近测定法相关申请的交叉引用本申请要求2016年8月26日提交的国际申请号PCT/US2016/049153的提交日期的权益，该申请要求2016年2月29日提交的美国临时专利申请号62/301,489的权益和2015年8月28日提交的美国临时专利申请号62/211,590的提交日期的权益，它们的公开内容特此通过引用整体并入本文。
所公开的实施方案涉及检测样本中的靶标，包括位于样品近侧的靶标。所公开的实施方案还提供了使用经掩蔽的半抗原(cagedhapten)或经掩蔽的半抗原缀合物检测福尔马林固定的、石蜡包埋的组织中的蛋白二聚体的邻近测定法(proximityassay)。工业适用性的声明本公开内容在化学和诊断领域中具有工业适用性。专利技术背景免疫组织化学(IHC)表示使用对特定抗原具有特异性的抗体对生物样品中的抗原（诸如蛋白）进行检测、定位和/或定量的方法。IHC提供了确切地识别特定蛋白位于组织样品内何处的实质性优点。它也是检查组织本身的有效方式。原位杂交(ISH)表示检测、定位和定量核酸的方法。IHC和ISH两者均可在各种生物样品诸如组织(例如新鲜冷冻的、福尔马林固定的、石蜡包埋的组织)和细胞学样品上进行。靶标的识别可以使用各种标记(例如，产色的、荧光的、发光的、放射性测量的标记)来检测，而不管靶标是核酸还是抗原。为了在临床场合稳健地检测、定位和定量靶标，识别事件的扩增是合乎需要的，因为确信地检测低丰度细胞标志物的能力对于诊断目的而言变得越来越重要。例如，响应于单个抗原检测事件而在标志物位点沉积数百或数千个标记分子，会通过扩增而增强检测该识别事件的能力。蛋白-蛋白相互作用的网络是生物系统的标志。蛋白-蛋白相互作用形成信号通路，其调节正常细胞和癌细胞的细胞功能的所有方面。已经开发了用于检测蛋白-蛋白相互作用的方法，诸如细胞外生长因子激活之后的瞬时型感受器酪氨酸激酶二聚化和复合物形成；但是，这些方法不是特别设计用于福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。对于已知在癌症生物学中是重要决定因素的生物标志物而言，询问特定分子间相互作用的存在和分布的能力在新的诊断能力的背景下是高度感兴趣的并且用于确定在药物开发背景下的治疗效果。在冷冻和石蜡包埋的组织上探测和记录分子相互作用分布的能力仍然无法获得；已经提出了解决该问题的替代技术，尽管解决方案没有被证明在实际使用中是有效和可靠的。OLinkAB最近已经开发了邻近连接测定法。这是在福尔马林固定的石蜡包埋的组织上原位检测蛋白-蛋白相互作用的唯一已知商业产品。邻近连接测定技术使用DNA连接酶来产生挂锁环形DNA模板，以及用于滚环扩增的Phi29DNA聚合酶。这些酶是昂贵的。而且，这些酶不适合与自动化系统和方法一起使用。因为这些原因，邻近连接测定法通常不被认为可用于商业应用。专利技术概述申请人已经开发了一种检测位于样品近侧的靶标的优良方法。在本公开内容的一个方面，是一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使所述第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的经掩蔽的半抗原暴露，以形成第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；(d)使所述样品与第一检测试剂接触，以标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或所述第一靶标；和(e)检测所述经标记的第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。在一些实施方案中，所述第一检测试剂包含(i)对所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体复合物的暴露的半抗原具有特异性的第二抗体，所述第二抗体缀合至第一酶，使得所述第二抗体用所述第一酶标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体复合物；和(ii)所述第一酶的第一底物。在一些实施方案中，所述第一底物是生色底物或荧光底物。在一些实施方案中，所述第一检测试剂包括扩增组分，以使用多个第一报告物部分标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物的暴露的酶。在一些实施方案中，所述多个第一报告物部分是半抗原。在一些实施方案中，所述第一检测试剂进一步包含对多个第一报告物部分具有特异性的第二抗体，每个第二抗体缀合至第二报告物部分。在一些实施方案中，所述第二报告物部分选自扩增酶或荧光团。在一些实施方案中，所述第二报告物部分是扩增酶并且其中所述第一检测试剂进一步包含所述扩增酶的第一生色底物或荧光底物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述样品与对所述第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物的暴露的酶具有特异性的第二底物接触和检测对应于所述第二底物与所述暴露的酶之间反应的产物的信号。在本公开内容的另一个方面，是一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使所述第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的经掩蔽的半抗原暴露，以形成第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；(d)执行信号放大步骤，以使用多个报告物部分标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；和(e)检测所述多个报告物部分。在一些实施方案中，所述多个报告物部分是半抗原；并且其中所述方法进一步包括引入对所述多个第一报告物部分具有特异性的第二抗体，每个第二抗体缀合至第二报告物部分。在一些实施方案中，所述第二报告物部分是扩增酶并且其中所述方法进一步包括引入所述扩增酶的生色底物或荧光底物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述样品中靶标的总量。在本公开内容的另一个方面，是一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)执行脱掩蔽步骤，使得所述第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物的暴露的酶与所述第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的酶底物部分反应，以形成第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；(d)使所述样品与第一检测试剂接触，以标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或所述第一靶标；和(e)检测所述经标记的第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。在一些实施方案中，所述脱掩蔽步骤包括改变所述样品的温度。在一些实施方案中，所述脱掩蔽步骤包括改变所述样品的pH。在一些实施方案中，所述脱掩蔽步骤包括引入一个或多个洗涤步骤。在一些实施方案中，所述脱掩蔽步骤包括加入所述暴露的酶的辅因子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述样品中的靶标的总量。在本公开内容的另一个方面，是一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与对所述第一靶标具有特异性的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物接触，以形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(b)使所述样品与对所述第二靶标具有特异性的暴露的酶-抗体缀合物接触，以形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物，其中选择所述暴露的酶-抗体缀合物的暴露的酶，使得它能够与所述经掩蔽的半抗原-抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a) 使所述样品与第二暴露的酶‑抗体缀合物接触，以形成第二靶标‑暴露的酶‑抗体缀合物复合物；(b) 使所述样品与第一经掩蔽的半抗原‑抗体缀合物接触，以形成第一靶标‑经掩蔽的半抗原‑抗体缀合物复合物；(c) 使所述第一靶标‑经掩蔽的半抗原‑抗体缀合物复合物的经掩蔽的半抗原暴露，以形成第一靶标‑暴露的半抗原‑抗体缀合物复合物；(d) 使所述样品与第一检测试剂接触，以标记所述第一靶标‑暴露的半抗原‑抗体缀合物复合物或所述第一靶标；和(e) 检测所述经标记的第一靶标‑暴露的半抗原‑抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标，其中所述第一经掩蔽的半抗原‑抗体缀合物具有式(IVC)或(IVD)的结构：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.26 US PCT/US2016/0491531.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与第二暴露的酶-抗体缀合物接触，以形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物；(b)使所述样品与第一经掩蔽的半抗原-抗体缀合物接触，以形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使所述第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的经掩蔽的半抗原暴露，以形成第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；(d)使所述样品与第一检测试剂接触，以标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或所述第一靶标；和(e)检测所述经标记的第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标，其中所述第一经掩蔽的半抗原-抗体缀合物具有式(IVC)或(IVD)的结构：其中“抗体”是抗体；“半抗原”是半抗原；A是基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；W是5、6或7元被取代的或未被取代的芳族环或杂环基团；Z是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子，每个R1独立地选自H、F、Cl、Br、I、-O-甲基、-O--乙基、-O-正丙基、-O--异丙基;-O-正丁基、-O-仲丁基或-O-异丁基；具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)2基团；具有1-4个碳原子且任选地被N或S取代的烷基；氰基基团；和羧基基团；V是键、被取代的或未被取代的具有1-4个碳原子的烷基、或被取代的或未被取代的-O-烷基；R3是酶底物；n是在1-25范围内的整数，且q是0或1；s是在1-4范围内的整数；且t是0或1。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一检测试剂包含(i)对所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体复合物的暴露的半抗原具有特异性的第二抗体，所述第二抗体缀合至第一酶，使得所述第二抗体用所述第一酶标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体复合物；和(ii)所述第一酶的第一底物。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一底物是生色底物或荧光底物。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一检测试剂包括扩增组分以用多个第一报告物部分标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物的暴露的酶。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述多个第一报告物部分是半抗原。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一检测试剂进一步包含对所述多个第一报告物部分具有特异性的第二抗体，每个第二抗体缀合至第二报告物部分。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二报告物部分选自扩增酶或荧光团。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第二报告物部分是扩增酶，且其中所述第一检测试剂进一步包含所述扩增酶的第一生色底物或荧光底物。9.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括使所述样品与第二底物接触，所述第二底物对所述第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物的暴露的酶具有特异性，和检测与所述第二底物和所述暴露的酶之间的反应的产物对应的信号。10.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与第二暴露的酶-抗体缀合物接触，以形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物；(b)使所述样品与第一经掩蔽的半抗原-抗体缀合物接触，以形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使所述第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的经掩蔽的半抗原暴露，以形成第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；(d)执行信号放大步骤，以用多个报告物部分标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；和(e)检测所述多个报告物部分，其中所述第一经掩蔽的半抗原-抗体缀合物具有式(IVC)或(IVD)的结构：其中“抗体”是抗体；“半抗原”是半抗原；A是基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；W是5、6或7元被取代的或未被取代的芳族环或杂环基团；Z是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子，每个R1独立地选自H、F、Cl、Br、I、-O-甲基、-O--乙基、-O-正丙基、-O--异丙基;-O-正丁基、-O-仲丁基或-O-异丁基；具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)2基团；具有1-4个碳原子且任选地被N或S取代的烷基；氰基基团；和羧基基团；V是键、被取代的或未被取代的具有1-4个碳原子的烷基、或被取代的或未被取代的-O-烷基；R3是酶底物；n是在1-25范围内的整数，且q是0或1；s是在1-4范围内的整数；且t是0或1。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述多个报告物部分是半抗原；且其中所述方法还包括引入对所述多个第一报告物部分具有特异性的第二抗体，每个第二抗体缀合至第二报告物部分。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二报告物部分是扩增酶，并且其中所述方法进一步包括引入所述扩增酶的生色底物或荧光底物。13.根据权利要求10所述的方法，所述方法进一步包括检测所述样品中的靶标的总量。14.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与第二暴露的酶-抗体缀合物接触，以形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物；(b)使所述样品与第一经掩蔽的半抗原-抗体缀合物接触，以形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)执行脱掩蔽步骤，使得所述第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物的暴露的酶与所述第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的酶底物部分反应，以形成第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；(d)使所述样品与第一检测试剂接触，以标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或所述第一靶标；和(e)检测所述经标记的第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标，其中所述第一经掩蔽的半抗原-抗体缀合物具有式(IVC)或(IVD)的结构：其中“抗体”是抗体；“半抗原”是半抗原；A是基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；W是5、6或7元被取代的或未被取代的芳族环或杂环基团；Z是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；每个R1独立地选自H、F、Cl、Br、I、-O-甲基、-O--乙基、-O-正丙基、-O--异丙基;-O-正丁基、-O-仲丁基或-O-异丁基；具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)2基团；具有1-4个碳原子且任选地被N或S取代的烷基；氰基基团；和羧基基团；V是键、被取代的或未被取代的具有1-4个碳原子的烷基、或被取代的或未被取代的-O-烷基；R3是酶底物；n是在1-25范围内的整数，且q是0或1；s是在1-4范围内的整数；且t是0或1。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述脱掩蔽步骤包括改变所述样品的温度。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述脱掩蔽步骤包括改变所述样品的pH。17.根据权利要求14所述的方法，其中所述脱掩蔽步骤包括引入一个或多个洗涤步骤。18.根据权利要求14所述的方法，其中所述脱掩蔽步骤包括加入所述暴露的酶的辅因子。19.根据权利要求14所述的方法，所述方法进一步包括检测所述样品中的靶标的总量。20.一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与对所述第一靶标具有特异性的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物接触，以形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(b)使所述样品与对所述第二靶标具有特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y贝洛斯卢切夫，TD德格尔，WJ弗兰奇，J郝，BD凯利，A穆里洛，NW波拉斯克，
申请(专利权)人：文塔纳医疗系统公司，
类型：发明
国别省市：美国,US