一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法技术

本发明专利技术公开了一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，步骤包括：1)调控实验室温度至22～30℃，湿度≤45％；2)提供带有石蜡包埋切片组织的载玻片；3)各种纯包埋剂的配制；4)EP管隔离圈的制备；5)顶扣包埋用EP管或预制包埋块的制备；6)脱蜡和水化；7)放置EP管隔离圈；8)固定和漂洗；9)脱水和浸透；10)顶扣包埋；11)聚合；12)剥离；13)修块、切片、染色及电镜观测采图。本发明专利技术的有益效果：本发明专利技术在节约试剂、减少试剂挥发所致误差的同时，使得最后得到的样品能完整剥离载玻片，方便了对石蜡包埋切片组织超微结构的进一步观察和研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于实验样品处理
，涉及一种石蜡包埋切片组织的样品制备方法，尤其涉及。
技术介绍
石蜡包埋切片技术是生物医学研宄领域中的重要手段，尤其是在临床病理诊断中具有重要作用。通过对石蜡包埋组织进行切片染色，可以观测到组织中的形态学变化，进而协助疾病的诊断，明确病因。一般石蜡包埋组织切片厚度多为2?5 μ m，切片后通过捞片平铺于载玻片上用于进一步的HE染色或者进行免疫组织化学染色等，利用不同结构呈现不同的颜色以便于协助观察和判断组织的形态结构变化。一些穿刺组织或者是体积微小的石蜡包埋组织，进行组织切片能得到的切片数量有限，尤其某些特殊的微小结构进行切片后可能仅能在一张或者数张切片上呈现，当需要进行多项检测时，往往由于切片数量不足而难以进行，因此，常常在不影响原有结果的前提下，对切片进行二次检测。石蜡包埋组织切片上的组织较好地贴合在载玻片上才能顺利进行染色，而用于进一步免疫组织化学染色的切片由于需要进行多步的漂洗及高温处理等，更需要组织能紧密地贴合在载玻片上以防止在操作过程中组织脱落而导致实验失败，因此常常使用表面做过特殊处理(一般为多聚赖氨酸处理)的载玻片进行捞片平铺使得切片组织更好地贴合而不易脱落，但这一特点也使得当需要截取载玻片上的组织做进一步研宄时，完好地获得组织的难度大大增加。穿刺组织和体积微小的组织，当需要对切片上局部稀少的更为复杂和精细的组织细胞内部结构做进一步研宄，借助透射电子显微镜能观察到特定的组织细胞的微观结构，正是越来越多相关研宄者的需求。但是切片较薄及贴合紧密的特点使得当需要对切片上的特定的部位进行透射电镜检测时，难以通过简单的刮取将组织刮下，而强行刮取载玻片上的组织常常会破坏组织的原有结构，难以定位到待检测结构，甚至使待检测结构丢失。对载玻片上微小的特定组织结构进行顶扣包埋，能充分利用已有的组织做进一步的透射电镜检测，尤其对于仅有的稀少组织的超微结构检测具有重要的意义。石蜡包埋组织透射电镜制样的脱蜡、固定、脱水、浸透和包埋等操作涉及到多种有毒性及挥发性液体如二甲苯、戊二醛、锇酸、丙酮等，在面积较大的载玻片上进行开放操作不仅会因液体挥发导致浓度改变进而影响样品的脱蜡、固定、脱水、浸透和包埋的效果，毒性挥发性试剂的大量使用还会对环境和健康造成影响。在对载玻片上的石蜡包埋切片组织进行顶扣包埋时，也存在包埋面过大导致含有待检测组织结构的包埋块无法完整地剥离载玻片的问题。因此，我们对常规透射电镜制样技术进行了改进，以使得石蜡包埋切片组织超微结构得到更好的呈现，解决了载玻片上的石蜡包埋切片组织在透射电镜制样过程中固定、包埋和截取时所出现的问题。同时也对解决该技术在应用于其他研宄领域时所出现的类似问题提供一定的参考。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中的缺陷，提供。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下:，按以下步骤操作:1.调控实验室温度至22?30°C，湿度彡45% ；2.提供带有石蜡包埋切片组织的载玻片，载玻片正面有待取样区域的石蜡包埋切片组织，待取样区域内包含待检测的组织，利用倒置显微镜对待取样检测的组织进行初步定位;3.各种纯包埋剂的配制(所用化学试剂均为分析纯):1)618包埋剂的配制:按重量份数分别将12份618、8份DDSA、1份DBP、0.5份DMP-30逐样加入量杯中，充分搅拌60?90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置_20°C冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37°C干燥箱解冻备用，其中618为环氧树脂，DDSA为2-十二烯基琥珀酸酐，DBP为邻苯二甲酸二丁酯，DMP-30为2-4-6-三-(二甲胺基甲基)苯酚；618包埋剂以下简称第一包埋剂；2) SPI — Pon? 812包埋剂的配制:将按重量份数分别将10份SP1- Ροη812、2.2份DDSA、8份NMA和0.3份DMP - 30逐样加入量杯中，充分搅拌60?90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafi Im封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置_20°C冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37°C干燥箱解冻备用，其中618为环氧树脂，DDSA为2-十二烯基琥珀酸酐，NMA为甲基纳迪克酸酐，DMP-30为2_4_6_三-(二甲胺基甲基)苯酚；SPI — Pon? 812包埋剂以下简称第二包埋剂；3) Spurr (4221)包埋剂的配制:按重量份数分别将10份ERL 4221、5份DER 736、26份NSA和0.3份DMAE逐样加入量杯中，充分搅拌60?90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置_20°C冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37°C干燥箱解冻备用，其中ERL 4221为环氧树脂，DER736为聚乙二醇环氧树脂，NSA为壬烯基琥珀酸酐，DMAE为二甲乙醇胺；Spurr(4221)包埋剂以下简称第三包埋剂；4.EP管隔离圈的制备:将EP管剪除管盖，截取管口及其下长度为I?2mm的完整一圈管作为隔离圈备用，所述EP管为锥形eppendorf离心管；5.顶扣包埋用EP管或预制包埋块的制备:I)顶扣包埋用EP管的制备:将上步骤制备EP管隔离圈余下的EP管继续往下截除小段，直至剩余的管能套入EP管隔离圈，并将EP管底部尖端截除，最后剩余的管作为顶扣包埋用EP管备用，切下的EP管底部尖端备用于最后密闭顶扣包埋用EP管；2)预制包埋块的制备:将配置好的第一包埋剂、第二包埋剂和第三包埋剂分别滴加入EP管中，将滴满包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合以得到包埋块，其中滴满纯包埋剂为第一包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为35°C、12h，45°C、12h，60°C、24h ;滴满纯包埋剂为第二包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为37°C、12h，45°C、12h，60°C、24h ;滴满纯包埋剂为第三包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为70°C、8?16h ;聚合完成后取出EP管中的包埋块备用；6.脱蜡和水化:将步骤2的载玻片放置于50mL离心管或50mL玻璃立缸，加入100%的二甲苯，使载玻片上的石蜡包埋组织全部浸没于二甲苯中，密闭离心管或玻璃立缸后放于烘箱中60 °C进行脱蜡3次，每次5?20min，再依次用体积浓度为100%、95%、90%、80%、70%和50%的乙醇溶液进行水化处理，每种浓度处理I?10s，最后用双蒸水处理I ?1s ；7.放置EP管隔离圈:将步骤6脱蜡和水化后的载玻片，在倒置显微镜的帮助下用标记笔于载玻片背面将组织待取样区域圈定，根据圈定的载玻片标记范围，于载玻片正面围绕待取样区域将组织的周边擦干，用镊子夹取步骤4的EP管隔离圈粘合于圈定的待取样区域上；8.固定和漂洗:于步骤7的载玻片上的EP管隔离圈内滴加前固定液，parafilm封口膜封闭后4°C进行前固定10?60min，用PBS缓冲液漂洗3次，每次5?20min，再滴加后固定液，parafilm封口膜封闭后4°C进行后固定10?60min，用PBS缓冲液漂洗3次，每次5?20min，得到固定和漂洗后的样品；所述前本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种石蜡包埋切片组织的透射电镜样品制备方法，其特征在于：依次由下述步骤组成，1)调控实验室温度至22～30℃，湿度≤45％；2)提供带有石蜡包埋切片组织的载玻片，载玻片正面有待取样区域的石蜡包埋切片组织，待取样区域内包含待检测的组织，利用倒置显微镜对待取样检测的组织进行初步定位；3)各种纯包埋剂的配制(所用化学试剂均为分析纯)：(1)618包埋剂的配制：按重量份数分别将12份618、8份DDSA、1份DBP、0.5份DMP‑30逐样加入量杯中，充分搅拌60～90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置‑20℃冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37℃干燥箱解冻备用，其中618为环氧树脂，DDSA为2‑十二烯基琥珀酸酐，DBP为邻苯二甲酸二丁酯，DMP‑30为2‑4‑6‑三‑(二甲胺基甲基)苯酚；618包埋剂以下简称第一包埋剂；(2)SPI－PonTM 812包埋剂的配制：将按重量份数分别将10份SPI–Pon 812、2.2份DDSA、8份NMA和0.3份DMP–30逐样加入量杯中,充分搅拌60～90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置‑20℃冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37℃干燥箱解冻备用，其中618为环氧树脂，DDSA为2‑十二烯基琥珀酸酐，NMA为甲基纳迪克酸酐，DMP‑30为2‑4‑6‑三‑(二甲胺基甲基)苯酚；SPI－PonTM 812包埋剂以下简称第二包埋剂；(3)Spurr(4221)包埋剂的配制：按重量份数分别将10份ERL 4221、5份DER 736、26份NSA和0.3份DMAE逐样加入量杯中，充分搅拌60～90min混匀，放置于真空干燥箱中静置待气泡排出，parafilm封口膜封闭，真空干燥器中备用，或者放置‑20℃冰箱保存，使用前提前拿出解冻至室温或放置37℃干燥箱解冻备用，其中ERL 4221为环氧树脂，DER 736为聚乙二醇环氧树脂，NSA为壬烯基琥珀酸酐，DMAE为二甲乙醇胺；Spurr(4221)包埋剂以下简称第三包埋剂；4)EP管隔离圈的制备：将EP管剪除管盖，截取管口及其下方长度为1～2mm的完整一圈管作为隔离圈备用；所述EP管为锥形eppendorf离心管；5)顶扣包埋用EP管或预制包埋块的制备：(1)顶扣包埋用EP管的制备：将上步骤制备EP管隔离圈余下的EP管继续往下截除小段，直至剩余的管能套入EP管隔离圈，并将EP管底部尖端截除，最后剩余的管作为顶扣包埋用EP管备用，切下的EP管底部尖端备用于最后密闭顶扣包埋用EP管；(2)预制包埋块的制备：将配置好的第一包埋剂、第二包埋剂和第三包埋剂分别滴加入EP管中，将滴满包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合以得到包埋块，其中滴满纯包埋剂为第一包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为35℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；滴满纯包埋剂为第二包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为37℃、12h，45℃、12h，60℃、24h；滴满纯包埋剂为第三包埋剂的EP管放入烘箱进行聚合时温度、时间条件为70℃、8～16h；聚合完成后取出EP管中的包埋块备用；6)脱蜡和水化：将步骤2的载玻片放置于50mL离心管或50mL玻璃立缸，加入100％的二甲苯，使载玻片上的石蜡包埋组织全部浸没于二甲苯中，密闭离心管或玻璃立缸后放于烘箱中60℃进行脱蜡3次，每次5～20min，再依次用体积浓度为100％、95％、90％、80％、70％和50％的乙醇溶液进行水化处理，每种浓度处理1～10s，最后用双蒸水处理1～10s；7)放置EP管隔离圈：将步骤6脱蜡和水化后的载玻片，在倒置显微镜的帮助下用标记笔于载玻片背面将组织待取样区域圈定，根据圈定的载玻片标记范围，于载玻片正面围绕待取样区域将组织的周边擦干，用镊子夹取步骤4的EP管隔离圈粘合于圈定的待取样区域上；8)固定和漂洗：于步骤7的载玻片上的EP管隔离圈内滴加前固定液，parafilm封口膜封闭后4℃进行前固定10～60min，用PBS缓冲液漂洗3次，每次5～20min，再滴加后固定液，parafilm封口膜封闭后4℃进行后固定10～60min，用PBS缓冲液漂洗3次，每次5～20min，得到固定和漂洗后的样品；所述前固定液是质量浓度为3％的戊二醛、所述后固定液是质量浓度为1％的锇酸、所述PBS缓冲液是0.1mol/L pH7.4的磷酸钠缓冲液；9)脱水和浸透：对上步骤固定和漂洗后的样品依次用4℃体积浓度为50％、70％、80％、90％的乙醇溶液进行处理，每次5～20min，接着用4℃体积比为1∶1的90％乙醇溶液和90％的丙酮溶液混合液对样品进行处理5～20min，然...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄远洁，莫肖敏，孟春梅，成晓静，李卫东，郑华，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西;45