本发明专利技术的根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物及其筛选应用，属于生物医学技术领域，相应的生物标志物如SEQ ID No.1～21所示。筛选时在分别鉴定出SCAP和BMMSCs两种间充质干细胞外泌体中存在piRNA的基础上，具体得出了SCAP和BMMSCs两种间充质干细胞中外泌体的piRNA测序数据，并记录差异表达的piRNA，包括15个上调piRNA和6个下调piRNA，即为生物标志物。结合文献计量学，将本评价方法和已有的研究结果对比分析，对研究根尖牙乳头干细胞和骨髓间充质干细胞生物学功能与特性具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物及其筛选应用
：本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物及其筛选应用。
技术介绍
：间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)是具有自我更新和多向分化潜能的祖细胞，具有多种生物学功能，尤其是在组织修复与再生中发挥重要作用。骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMMSCs)是中胚层来源的干细胞，可作为种子细胞应用于组织工程、基因治疗和移植等领域。而根尖牙乳头干细胞(Stemcellfromtheapicalpapilla，SCAP)是从人未发育成熟的恒牙根尖牙乳头中分离得到的一种外胚层神经嵴来源的间充质干细胞，与BMMSCs相比较具有更高的增殖、迁移、分化和免疫调节能力，并且来源丰富，不存在伦理及法律上的争议，是组织工程中理想的种子细胞来源。目前这两种干细胞尚没有统一的评价其生物学功能特性的方法。外泌体是细胞分泌的微囊泡，直径为30-150nm，包被细胞的双层脂膜结构。外泌体是介导细胞之间相互交流的一种重要方式。外泌体中含有多种活性成分，包括脂质、蛋白质、RNA和DNA等，特别是外泌体中所包含的RNA，被认为是调控受体细胞的主要物质。MSCs来源的外泌体与MSCs有着相似的功能，包括促进组织修复与再生、抑制炎症反应及调节机体免疫等。piRNA(PIWI-interactingRNA)是近年来发现的一类新型小非编码RNA，通过与PIWI家族蛋白结合调控靶基因和转座子的活性。piRNA在维持干细胞基因组稳定和哺乳动物精子生成过程中发挥重要作用，与干细胞功能紧密相关。
技术实现思路
：本专利技术的目的是评价根尖牙乳头干细胞和骨髓间充质干细胞的生物学功能，探讨其在再生医学领域的应用，提供一种根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物及其筛选应用，涉及干细胞与再生医学、分子生物学和转录组学，尤其涉及应用二代测序技术分析根尖牙乳头干细胞和骨髓间充质干细胞外泌体中piRNA表达谱的方法，并将该方法用于评价干细胞功能特性，具体获得了SCAP和BMMSCs两种间充质干细胞外泌体的piRNA测序数据，并对差异表达的piRNA靶基因进行功能富集和信号通路分析。结合文献计量学，通过资料查询及大量文献检索，将本评价方法和已有的研究结果对比分析，为评价根尖牙乳头干细胞和骨髓间充质干细胞功能特性和应用提供新的方法和技术手段。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物，如SEQIDNo.1～21所示，包括：hsa_piR_001168，hsa_piR_020326，hsa_piR_017724，hsa_piR_002332，hsa_piR_011273，hsa_piR_019521，hsa_piR_020793，hsa_piR_020388，hsa_piR_019949，hsa_piR_017716，hsa_piR_016946，hsa_piR_001184，hsa_piR_014620，hsa_piR_001788，hsa_piR_012895，hsa_piR_002811，hsa_piR_020829，hsa_piR_008803，hsa_piR_019912，hsa_piR_007832，hsa_piR_015026。所述的根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：(1)间充质干细胞上清液的收集：分别对根尖牙乳头干细胞SCAP和骨髓间充质干细胞BMMSCs进行培养，使各自细胞融合度达到80％后，在去外泌体血清培养基中，连续培养48h后，分别收集SCAP培养基上清液和BMMSCs培养基上清液；(2)外泌体提取：对步骤(1)收集的间充质干细胞培养基上清液，分别相应进行外泌体提取操作；(3)总RNA提取：将步骤(2)收集的外泌体，分别相应进行各自总RNA提取操作；(4)sRNA文库的建立及测序：对步骤(3)获取的总RNA分别相应进行PCR扩增，构建各自的sRNA文库，并进行高通量并行测序；(5)测序结果的处理和注释：对步骤(4)测序后获得序列初步过滤，得到干净序列；各自分别与Rfam和piRNA数据库比对，将两数据库重复所得sRNA分类注释结果进行统计，鉴定SCAP外泌体和BMMSC外泌体中含有piRNA，并记录各自piRNA的表达结果；(6)两样本piRNA比对进行表达差异分析：根据(5)统计得到的SCAP外泌体和BMMSCs外泌体中piRNA的表达结果比对，进行差异分析，差异标准为|log2(foldchange)|＞1；P＜0.05，筛选出差异表达的piRNA，共21个，其中包括SEQIDNo.1～15为15个上调piRNA，SEQIDNo.16～21为6个下调piRNA，即为生物标志物，并记录差异表达结果。所述的步骤(1)中，SCAP经提取获得，提取过程为：取未发育完成的年轻恒牙，提取根尖牙乳头，经分离，获得根尖牙乳头干细胞。所述的步骤(1)中，BMMSCs来自市购。所述的步骤(2)中，采用ExoQuick-TCTM试剂盒对上清液进行外泌体提取操作。所述的步骤(3)中，采用Trizol试剂对提取到的外泌体进行总RNA提取操作。所述的根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物作为SCAP特异性的鉴别诊断标志物的应用。所述的根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物在制备用于评价组织再生能力试剂盒中的应用。所述的根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物在制备相应piRNA的抑制剂及其在骨再生和血管生成中的应用。所述的根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物在制备相应piRNA的模拟物及其在神经再生和血管再生中的应用。对差异表达的piRNA进行靶基因预测，获得差异表达piRNA的靶基因，然后对差异表达piRNA的靶基因进行GO/KEGG功能富集分析，获得分析结果，具体的利用本方法评价干细胞功能特性和现有文献比对研究：对功能富集的pathway同美国国家医学图书馆下属的国家生物技术信息中心开发的数据库Pubmed中现有文献比对，进一步评估本方法在评价SCAP及BMMSCs生物学功能特性方面的可行性。二代测序技术具有极高的测序速度和高度准确性，能够达到测序成本低、通量高，具有大规模应用的潜能。因此，本实验应用二代测序技术分析根尖牙乳头干细胞和骨髓间充质干细胞外泌体中piRNA表达谱，以及对差异表达的piRNA靶基因功能进行分析，对研究根尖牙乳头干细胞和骨髓间充质干细胞生物学功能与特性具有重要意义。本专利技术的有益效果：本专利技术通过高通量测序技术建立小RNA数据库，具有分辨率高、精确度高，重复性高且成本低的优势，可全面获取SCAP和BMMSCs两种间充质干细胞外泌体中piRNA的表达信息。根据SCAP和BMMSCs外泌体中piRNA的表达信息，分析piRNA差异表达结果，对表达的piRNA进行靶基因预测和靶基因GO/KEGG功能富集分析，深入研究差异表达的piRNA功能。piRNA是一种可调控基因表达的非编码RNA，对外泌体中piRNA功能的深度挖掘，有助于进一步研究根尖牙乳头干细胞和骨髓间充质干细胞的生物学功能，并提供本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物，其特征在于，如SEQ ID No.1～21所示，包括：hsa_piR_001168，hsa_piR_020326，hsa_piR_017724，hsa_piR_002332，hsa_piR_011273，hsa_piR_019521，hsa_piR_020793，hsa_piR_020388，hsa_piR_019949，hsa_piR_017716，hsa_piR_016946，hsa_piR_001184，hsa_piR_014620，hsa_piR_001788，hsa_piR_012895，hsa_piR_002811，hsa_piR_020829，hsa_piR_008803，hsa_piR_019912，hsa_piR_007832，hsa_piR_015026。
【技术特征摘要】
1.根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物，其特征在于，如SEQIDNo.1～21所示，包括：hsa_piR_001168，hsa_piR_020326，hsa_piR_017724，hsa_piR_002332，hsa_piR_011273，hsa_piR_019521，hsa_piR_020793，hsa_piR_020388，hsa_piR_019949，hsa_piR_017716，hsa_piR_016946，hsa_piR_001184，hsa_piR_014620，hsa_piR_001788，hsa_piR_012895，hsa_piR_002811，hsa_piR_020829，hsa_piR_008803，hsa_piR_019912，hsa_piR_007832，hsa_piR_015026。2.权利要求1所述的根尖牙乳头干细胞外泌体piRNA生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)间充质干细胞上清液的收集：分别对根尖牙乳头干细胞SCAP和骨髓间充质干细胞BMMSCs进行培养，使各自细胞融合度达到80％后，在去外泌体血清培养基中，连续培养48h后，分别收集SCAP培养基上清液和BMMSCs培养基上清液；(2)外泌体提取：对步骤(1)收集的间充质干细胞培养基上清液，分别相应进行外泌体提取操作；(3)总RNA提取：将步骤(2)收集的外泌体，分别相应进行各自总RNA提取操作；(4)sRNA文库的建立及测序：对步骤(3)获取的总RNA分别相应进行PCR扩增，构建各自的sRNA文库，并进行高通量并行测序；(5)测序结果的处理和注释：对步骤(4)测序后获得...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈旭，刘洁，王傲晨，刘尧，朱姝，戴璐，余思，
申请(专利权)人：中国医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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