一种能够治疗癌症的小干扰RNA制造技术

本发明专利技术提供一种能够治疗癌症的小干扰RNA，该小干扰RNA为针对DD3基因具有改进的抑制效果的修饰的siRNA，能够大幅度的提高针对癌细胞的生殖抑制率，同时也提高了血清学的稳定性，具有极高的应用价值以及应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种能够治疗癌症的小干扰RNA
本专利技术涉及一种siRNA及其应用。具体而言，本专利技术涉及一种抑制DDK3基因表达的小干扰RNA及其特异性修饰用于延长血清半衰期中的应用。
技术介绍
DD3定位于第9号染色体上(9q21-22),全长约25kb,包含3个内含子和4个外显子。1号内含子较长(20kb)；2号内含子(873bp)和3号内含子(227bp)较短。外显子4由3个亚单位4a、4b和4c所组成。Northernblot分析发现外显子1、3和4a都存在3种不同的转录产物分别为0.6kb、2kb和4kb,而外显子4c则仅存在于最大的转录产物中,4b出现在两个较大的转录产物中(4kb)。虽然外显子2也是3种转录产物的一部分,但其转录产物有限(5％),而外显子1、3、4a和4b在克隆中的频率较高(60％)。DD3开放阅读框架(openreadingframe,ORF)分析显示DD3序列中含有高密度的终止信号,表明DD3是编码的RNA,但其蛋白产物非常少。Grail软件(可检测到人类RNA编码区)分析发现DD3与其他基因不存在同源性,DD3基因中分布着数个小的开放阅读框架,DD3最有可能的ORF位于外显子3和4a。外显子2的交替拼接或使用CTG(或ACG)作为翻译的启动子不能明显加长任何ORF。DD3被表达为接合和多聚腺苷酸化的RNA分子,表明DD3是一种非编码RNA基因,而不是一种假基因。DD3是一种非编码RNA基因,而不是一种假基因。目前DD3基因的第一个作用为在临床检测应用。(1)DD3的前列腺特异性研究Liag等用差异显示PCR分析胚胎细胞在mRNA水平的分子表达,DD3Pca3mRNA在不同组织细胞中的表达不同,并且在前列腺细胞的不同阶段和状态中的DD3Pca3mRNA表达也有差异。有文献报道用RT-PCR方法,在健康男性和女性供血者血液和前列腺及其他器官的不同的肿瘤及非瘤组织调查了在人类细胞系中D3P基因的表达,发现DD3的唯一前列腺特异区域为外显子4。DD3在正常前列腺中表达水平较低,在其他正常组织、血液或其他肿瘤标本中不表达。Schalken等报道DD3Pca3对前列腺癌高度特异,在其他人体正常组织如乳腺、膀胱、睾丸、胃肠器官、肌骨胳组织中不表达,在正常前列腺组织中低水平表达,肾脏组织中有极低水平的表达。这些研究表明DD3Pca3最适合作为前列腺癌特异性标志物。(2)前列腺组织中DD3Pca3的检测Landers等用实时定量PCR检测前列腺癌组织中的DD3mRNA表达,证实前列腺癌组织中DD3是良性前列腺增生组织的140倍。Thelen等对激光显微解剖分离的前列腺正常组织和癌组织进行cDNA微阵列分析证实DD3在所有病例的癌组织中均过表达。在Bussemakers等发现前列腺癌DD3mRNA的表达水平与前列腺癌Gleason病理分级相关。(3)尿液和其它标本中DD3Pca3检测Gandini用PCR方法除了对前列腺组织、不同的细胞系、外周血前列腺癌细胞的RNA进行检测外还对前列腺按摩或穿刺后尿液进行了DD3Pca3RNA检测,为了减少样本间RNA提取效率、逆转录及扩增的差异对PCR结果带来的误差,用β-肌动蛋白(β-actin)基因作内参对照,结果发现,不同分化程度的前列腺癌DD3Pca3mRNA均呈阳性。Tinzl对直肠触诊后脱落进入尿液的前列腺癌细胞进行了DD3检测。用核酸序列分析(uPM3)检测尿标本DD3RNA和PSAmRNA。在201例病人中,158例(78.6％)尿标本含足量的前列腺细胞,能满足DD3分析,其中62例(39％)发现前列腺。uPM3分析的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为82％、76％、67％和87％,相应的tPSA分析别为98％、5％、40％和83％(参考值2.5ng/ml),uPM3分析DD3远优于tPSA分析的特异性。Hessels等用定量RT-PCR在研究了108例PSA>3ng/ml的非恶性和恶性前列腺疾病患者前列腺按摩后尿沉渣中定量检测DD3转录,同时做前列腺活检组织检查。从血清PSA>3ng/ml的结果108例患者中24例活检组织发现有前列腺癌,在这24例中16例尿沉渣检查DD3阳性,敏感性为67％,阴性预期值90％。因此定量RT-PCR检测DD3作为一种分子尿液分析的工具具有很大的运用前景。除尿液外也可对临床中前列腺针剌组织或其他体液如精液或前列腺按摩液等标本进行DD3检测。(4)前列腺癌细胞系中DD3Pca3的研究vanBokhoven等观察了21个前列腺癌细胞系,发现8个(4对)与原发性癌相关,9例显示出AR(androgenreceptor,AR)表达。前列腺特异性抗原和DD3在AR表达的细胞系中特别地检测到,这些细胞系由前列腺癌的不同类型和阶段组成,部分地反映了这些恶性变的不同类型的特征。DD3基因的第二个作用与前列腺癌基因治疗有关。DD3具有高度的前列腺癌特异性,且在DD3阳性的前列腺癌细胞中该启动子具有高活性。理论上通过合适载体把自杀基因送入肿瘤目标细胞,与肿瘤特异性启动子结合,在细胞内装配成适当的转录启动复合物,编码产生酶-前药激活物,进入肿瘤细胞中的前药在激活物作用下活化并具备杀伤肿瘤细胞作用,并最终可能使肿瘤目标细胞死亡。Schalken等认为增强子可以使启动子的表达提高到20倍,这也使DD3为基础的结构域成为未来前列腺癌基因治疗的理想候选对象。未来研究中还需要明确与启动子结合的转录因子、其结合位点、活化和抑制物质以及复合物构型变化等。在针对DD3进行疾病治疗中，可以针对DD3基因进行敲除。比如CN104357451A公开一种针对DD3基因的小干扰RNA及其表达载体构建与应用。其正义链序列为SEQIDNO.1；反义链序列为SEQIDNO.2；并成功构建了pGLV3/H1/GFP+PuroVector-DD3-siRNA真核表达载体。本专利技术将成功构建的真核表达载体感染LNCaP细胞及RWPE-1细胞，结果显示，DD3基因被干扰后能明显降低LNCaP细胞增殖速率，而对RWPE-1细胞无明显影响；将成功构建的真核表达载体注射到前列腺癌动物实体瘤中，结果显示，DD3基因被干扰后能有效抑制LNCaP细胞实体瘤的增殖。因此，通过siRNA干扰DD3基因在前列腺癌细胞中的表达，从而抑制了癌细胞的增殖。但是该方法抑制效率还有待提高，同时血清学稳定性也不高，仍有大幅提高的空间。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于抑制DD3基因表达的siRNA、含有所述siRNA作为药物活性成分的药物组合物、利用所述siRNA或药物组合物抑制DD3基因表达的方法，以及所述siRNA或药物组合物在治疗和/或预防癌症疾病中的应用。即，本专利技术通过提供以下技术方案得以实现本专利技术的上述目的。一方面，本专利技术提供一种具有双链结构的siRNA，所述双链结构由完全互补的第一单链和第二单链组成。其中，所述siRNA为DD3-137：所述第一单链具有与由SEQIDNO：11表示的DD3mRNA序列中的靶位点序列相同且由SEQIDNO：1表示的核苷酸序列，第二单链组成为SEQIDNO：2。进一步的，所述siRNA为DD3-335：所述第一单链具有与由SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有双链结构的siRNA，所述双链结构由完全互补的第一单链和第二单链组成，其中，所述第一和第二链分别如SEQ ID NO：1和2、或SEQ ID NO：3和4、或SEQ ID NO：5和6、或SEQ ID NO：7和8、或SEQ ID NO：9和10、或SEQ ID NO：11和12、或SEQ ID NO：13和14中任一所示。

【技术特征摘要】
1.一种具有双链结构的siRNA，所述双链结构由完全互补的第一单链和第二单链组成，其中，所述第一和第二链分别如SEQIDNO：1和2、或SEQIDNO：3和4、或SEQIDNO：5和6、或SEQIDNO：7和8、或SEQIDNO：9和10、或SEQIDNO：11和12、或SEQIDNO：13和14中任一所示。2.一种药物组合物，其中，含有权利要求1中所述的siRNA作为药物活性成分，以及还含有阳离子组分、非阳离子组分和药学上可接受的载体。3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中，所述阳离子组分选自N，N-二羟乙基-N-甲基-N-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵、(2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵、聚乙烯亚胺、聚β-氨基酯和壳聚糖季铵盐中的至少一种，所述非阳离子组分选自聚乙二醇-聚乳酸两嵌段共聚物、...

【专利技术属性】
技术研发人员：巫满香，王平，
申请(专利权)人：宜春莲泽生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36