一种AMO-miR-137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种AMO‑miR‑137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用，所述高效抵抗WSSV的AMO‑miR‑137的序列为：5’‑ACGUGUAUUCUCAAGCAAUAA‑3’。本发明专利技术的AMO‑miR‑137能抑制WSSV在拟穴青蟹、日本囊对虾及克氏原螯虾体内的增殖，显著提高虾血淋巴细胞的活力，增强虾对病毒的抵抗能力，高效的抑制WSSV病毒的传播感染。本发明专利技术的AMO‑miR‑137适用范围广泛，不仅适用于海水养殖的日本囊对虾及拟穴青蟹，同样也适用于淡水养殖的克氏原螯虾。本发明专利技术的AMO‑miR‑137分子质量小易降解，不会破坏养殖生态平衡，且不会对人的身体健康造成危害，绿色环保；为水产养殖中抗白斑综合症病毒提供了一种潜在的药物，不仅适用于预防，也可适用在已爆发白斑综合症的虾蟹的养殖过程。

【技术实现步骤摘要】
一种AMO-miR-137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用
本专利技术涉及水产养殖的病毒性疾病防治领域，尤其涉及一种AMO-miR-137在制备抗白斑综合症病毒抑制剂中的作用。
技术介绍
拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)，简称青蟹，具有生长快、肉质鲜美、营养价值高等特点，在海产市场中备受青睐，是我国东南沿海重要经济蟹类之一，也是许多国家人工养殖的主要海洋蟹类品种。日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)俗称车虾，分布十分广泛，从非洲东部海域、红海到朝鲜日本一带都有分布，在我国主要分布在东海和南海。其具有肉质鲜美、营养价值高、生存能力强、等特点，是对虾中价值最高的一个品种。克氏原螯虾(Procambarusclarkii)因其形态与海水龙虾相似，因而被称为淡水龙虾。1929年由日本引进我国，具有生长快、易饲养、食性杂、养殖方法灵活、抗病能力强等优势，该虾肉味鲜美，营养丰富，是新兴的淡水养殖品种。但是随着现代化高密度养殖的发展，养殖过程中疾病的爆发日趋频繁，细菌、病毒感染等引起的各种疾病给水产养殖业带来了日益严重的影响，给国家的农业收入造成了巨大的损失。疾病监控困难严重制约了水产养殖业的可持续发展。尤其是伴随着近年各种虾蟹混养模式的快速发展，一些原发于虾类的疾病也通过接触或水体传染给了蟹类，对虾白斑综合征病毒(WhiteSpotSyndromvirus，WSSV)就是一个典型事件。WSSV对宿主具有泛嗜性，几乎所有的十足甲壳类都会被感染，且传播途径众多。一旦出现WSSV感染，如果不及时采取措施，极容易形成爆发之势，难以控制。与脊椎动物不一样的是，无脊椎动物缺少以抗原抗体特异性为基础的获得性免疫系统，其主要依靠一系列的先天性免疫机制来抵御病原微生物的入侵和进一步感染，这大大增加了养殖过程中的病毒防治工作的难度。现有的防治措施有：使用广谱性的抗生素，此法虽有一定效果，但作用时间短，药物残留严重，污染环境，还有可能催生耐药菌而严重危害人类健康，影响生态平衡以及海水与淡水养殖业的可持续发展，因此筛选抗白斑综合症病毒的高效、安全的药物具有重要的意义。miRNA是长度约为21-24个核苷酸的单链RNA，通过与靶基因mRNA配对结合，进而抑制靶基因的表达，发挥着转录后调控的功能。最近的研究表明，miRNA在宿主与病毒的互作过程中发挥着关键的作用，miRNA作为抗病毒治疗的候选药物具备良好的应用前景。目前关于抵抗WSSV的药物专利技术较少，主要有拟穴青蟹抗脂多糖因子SP-ALF2(专利号：201110327329.5)，其为一种体外原核表达的重组蛋白，制备方法较繁琐。此外，还有防治小龙虾白斑综合症的免疫增强剂(专利号：201611090048.1)，其由维生素E、酵母核酸、左旋咪唑、干扰素、聚乙二醇制成。此免疫增强剂需溶解至水中，搅拌混匀后喷洒至小龙虾养殖水域，并在3至4小时后，重复喷洒一次。再如，Cq-Nslabp基因及其蛋白在鳌虾抗病毒中的应用(专利号：201810031865.2)等。上述专利技术步骤繁琐，或者所需材料种类繁多且见效慢。其所包含的材料分子质量相对较大，降解难易程度未知，其残留是否会影响人体健康也未知，其是否会影响养殖生态平衡也未知。因此，寻找方法简单，分子质量较小，易降解，有效的防治方法极为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种小RNA反义核酸AMO-miR-137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用，本专利技术的小RNA反义核酸AMO-miR-137能够抑制WSSV在拟穴青蟹、日本囊对虾和克氏原螯虾体内的复制，有效抑制病毒的传播感染，以解决WSSV对海水及淡水养殖虾蟹类感染并致死的现象等问题。一种高效抵抗WSSV的AMO-miR-137，序列为：5’-ACGUGUAUUCUCAAGCAAUAA-3’。上述高效抵抗WSSV的AMO-miR-137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用。进一步的，所述制剂包括含AMO-miR-137的饲料添加剂、固体或者液体药物。进一步的，所述广谱抗白斑综合症病毒制剂可用于甲壳类动物。进一步的，所述甲壳类动物包括海水养殖蟹类、海水养殖虾类和淡水养殖虾类。进一步的，所述甲壳类动物包括日本对虾、克氏原螯虾和拟穴青蟹。一种包含上述高效抵抗WSSV的AMO-miR-137的制剂。本专利技术通过研究miRNA在WSSV感染过程中的表达情况，发现拟穴青蟹受到白斑综合症病毒感染后体内的miR-137显著下调，表明miR-137可能参与了宿主病毒间的互作过程，是潜在的WSSV防治的新靶点。随后对拟穴青蟹进行攻毒实验并分别在青蟹体内过表达及抑制miR-137。结果表明上调miR-137的表达量后宿主体内病毒拷贝数显著增加，相反利用AMO-miR-137抑制miR-137的表达量后宿主体内的病毒拷贝数显著下降，其作用机制是诱导宿主细胞发生凋亡进而抑制WSSV在拟穴青蟹体内的复制。此外，为了证明AMO-miR-137作为抗WSSV药物的泛适性，我们在日本囊对虾及克氏原螯虾中进行了相关功能验证试验，发现AMO-miR-137能够抑制WSSV在日本囊对虾及克氏原螯虾体内的增殖，显著提高虾血淋巴细胞的活力，增强虾对病毒的抵抗能力。因此，AMO-miR-137有望成为抗WSSV的新药物，广泛应用于水产养殖过程中WSSV的防治工作。与现有技术相比，本专利技术具有以下优势：(1)适用范围广泛，不仅适用于海水养殖的拟穴青蟹及日本囊对虾，同样也适用于淡水养殖的克氏原螯虾，是一种潜在的广谱抗WSSV的药物，广泛应用于水产养殖过程中WSSV的防治工作。(2)本专利技术AMO-miR-137属于核酸合成物，分子质量小易降解，不会破坏养殖生态平衡，且不会对人的身体健康造成危害，绿色环保。(3)本专利技术的抗白斑综合症病毒制剂可以只包含AMO-miR-137单一的化学物，本专利技术更易应用于实际生产。(4)本专利技术AMO-miR-137，不仅适用于预防，也可适用在已爆发白斑综合症的虾蟹的养殖过程。本专利技术AMO-miR-137可显著抑制WSSV在宿主体内的复制，有效抑制病毒的进一步传播。附图说明图1为WSSV感染拟穴青蟹后，拟穴青蟹血细胞中miR-137的表达量。图2为miR-137模拟物对拟穴青蟹血细胞中miR-137表达量的影响；将miR-137及miR-137-scrambled分别注射至拟穴青蟹体内，利用qPCR检测血细胞中miR-137的表达量。图3为miR-137模拟物对拟穴青蟹体内WSSV复制的影响；将miR-137或miR-137-scrambled混合WSSV后分别向拟穴青蟹体内注射；检测WSSV感染青蟹0、24和48小时后WSSV的拷贝数。图4为AMO-miR-137对拟穴青蟹血细胞中miR-137表达量的影响；将AMO-miR-137及AMO-miR-137-scrambled分别注射至拟穴青蟹体内，利用qPCR检测血细胞中miR-137的表达量。图5为AMO-miR-137对拟穴青蟹体内WSSV复制的影响；将AMO-miR-137或AMO-miR-137-scrambled混合WSSV后分别向拟穴青蟹体内注射；检测WSSV感染青蟹0、24和48小时后WSSV的拷贝数。图6为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效抵抗WSSV的AMO‑miR‑137，其特征在于，序列为：5’‑ACGUGUAUUCUCAAGCAAUAA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种高效抵抗WSSV的AMO-miR-137，其特征在于，序列为：5’-ACGUGUAUUCUCAAGCAAUAA-3’。2.根据权利要求1所述高效抵抗WSSV的AMO-miR-137在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂包括含AMO-miR-137的饲料添加剂、固体或者液体药物。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚燚，李升康，林善梦，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：广东,44