【技术实现步骤摘要】
一种双sgRNA位点敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统与应用
本专利技术属于生物工程
,特别涉及肿瘤发生、发展相关基因敲除方法,具体涉及一种双sgRNA位点敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统与应用。
技术介绍
胰岛素除去前体信号肽后,被切割成三种肽:B链肽和A链肽,它们通过两个二硫键共价连接形成胰岛素和C链肽。胰岛素与胰岛素受体(INSR)的结合刺激葡萄糖摄取。而近期研究表明INS基因和肿瘤细胞耐药相关,肿瘤细胞在顺铂处理后INS基因表达量急剧增加,而其具体耐药机制尚未清楚,深入研究INS基因功能有助于发现肿瘤耐药的重要机制,为肿瘤的个性化治疗提供新的思路。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御,可用来消除入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中,并利用相应的CRISPRRNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解,从而提供免疫性。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物,此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链RNA。通过人工设计这两种RNA,可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA),引导Cas9对DNA的进行定点切割,CRISPR/Cas系统具有操作简单,剪切效率高等特点。目前,CRISPR/Cas基因敲除技术已广泛应用于果蝇、大鼠、小鼠、 ...
【技术保护点】
1.一种敲除INS基因的sgRNA,其特征在于,包括INS sgRNA‑1和INS sgRNA‑2;所述INS sgRNA‑1的序列如下:INS sgRNA‑1:CCACCAGGTGTGAGCCGCAC;INS sgRNA‑1 oligo1:5’‑caccgCCACCAGGTGTGAGCCGCAC‑3’;INS sgRNA‑1 oligo2:5’‑aaacGGAGGGGAACTTCCTACACCc‑3’;所述INS sgRNA‑2的序列如下:INS sgRNA‑2:TACCTAGTGTGCGGGGAACG;INS sgRNA‑2 oligo1:5’‑caccgTACCTAGTGTGCGGGGAACG‑3’;INS sgRNA‑2 oligo2:5’‑aaacCGTTCCCCGCACACTAGGTAc‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种敲除INS基因的sgRNA,其特征在于,包括INSsgRNA-1和INSsgRNA-2;所述INSsgRNA-1的序列如下:INSsgRNA-1:CCACCAGGTGTGAGCCGCAC;INSsgRNA-1oligo1:5’-caccgCCACCAGGTGTGAGCCGCAC-3’;INSsgRNA-1oligo2:5’-aaacGGAGGGGAACTTCCTACACCc-3’;所述INSsgRNA-2的序列如下:INSsgRNA-2:TACCTAGTGTGCGGGGAACG;INSsgRNA-2oligo1:5’-caccgTACCTAGTGTGCGGGGAACG-3’;INSsgRNA-2oligo2:5’-aaacCGTTCCCCGCACACTAGGTAc-3’。2.一种双sgRNA位点靶向敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统,其特征在于,包括权利要求1所述INSsgRNA-1和INSsgRNA-2的DNA序列。3.如权利要求2所述的双sgRNA位点靶向敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤1,使用BsmbI酶切CRISPR/Cas9载体LentiCRISPRV2,得到酶切后的载体;步骤2,将所述靶向敲除INS基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后与酶切后的LentiCRISPR-V2载体连接,得到得到靶向敲除INS基因的LentiCRISPRV2-INSsgRNA-1&LentiCRISPRV2-INSsgRNA-2,构建靶向敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统。4.如权利要求2或3所述靶向敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统在制备敲除INS基因的细胞株中的应用。5.一种敲除INS基因的细胞株,其特征在于,所述细胞株是运用权利要求2所述双sgRNA位点靶向敲除INS基因的CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除得到的细胞中的INS基因缺失的细胞株。6.如权利要求5所述的敲除INS基因的细胞株,其特征在于,所述细胞株为A549细胞株。7.如权利要求5所述的敲除INS基因的细胞株,其特征在于,所述IN...
【专利技术属性】
技术研发人员:赵恩峰,贺小宏,王延宾,任江涛,韩露,
申请(专利权)人:南京北恒生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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