本发明专利技术公开了一种东北红豆杉的分子特异性标记引物及其鉴别方法。当前方法对东北红豆杉的真伪鉴别效率不高，且准确率低下。本发明专利技术中东北红豆杉分子特异性标记为特异性引物DHDSF/DHDSR。特异性引物DHDSF/DHDSR作为扩增引物，通过常规PCR扩增反应和琼脂糖电泳检测，可以高效、准确的鉴别东北红豆杉样品。DHDSF/DHDSR为东北红豆杉的特异性扩增引物，待测样品为东北红豆杉，则会扩增出486bp大小的特异性DNA电泳条带；若待测样品为其他近缘红豆杉物种样品，则为阴性反应。本发明专利技术方法操作简单，用时短，且结果准确，是传统形态学方法鉴别东北红豆杉的有效辅助手段。
A Molecular Specific Marker Primer for Taxus cuspidata and Its Identification Method
The present invention discloses a molecular specific marker primer of Taxus cuspidata and its identification method. Current methods are inefficient and inefficient in identifying the authenticity and falsity of Taxus cuspidata. The molecular specific marker of Taxus cuspidata is a specific primer DHDSF/DHDSR. Specific primers DHDSF/DHDSR as amplification primers, through routine PCR amplification reaction and agarose electrophoresis detection, can effectively and accurately identify Taxus cuspidata samples. DHDSF/DHDSR is a specific amplification primer for Taxus cuspidata, and 486 BP DNA electrophoretic bands will be amplified for Taxus cuspidata, while negative for other related Taxus species. The method has the advantages of simple operation, short use time and accurate results, and is an effective auxiliary means for identifying Taxus cuspidata by traditional morphological methods.
【技术实现步骤摘要】
一种东北红豆杉的分子特异性标记引物及其鉴别方法
本专利技术属于东北红豆杉分子鉴定领域，涉及一种东北红豆杉的分子特异性标记引物，以及利用该特异性标记引物对东北红豆杉进行快速鉴别的方法。
技术介绍
东北红豆杉TaxuscuspidataS.etZ.，又名赤柏松、米树(东北)，宽叶紫杉，是裸子植物亚门(Cymnospermai)松杉纲(Coniferopside)红豆杉目(Taxales)红豆杉科中(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)多年生常绿乔木植物。主要分布于中国吉林老爷岭、张广才岭及长白山区，日本、朝鲜、俄罗斯也有分布。东北红豆杉具有非常高的观赏价值、药用价值和保健价值，是世界上公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物，在地球上已有250万年的历史，是植物活化石。东北红豆杉中的紫杉醇被认为是治愈多种癌症的新型抗癌药物。自然繁殖更新能力较低，加上人类过度砍伐，东北红豆杉资源非常稀少，1996年联合国教科文组织将其列为世界珍稀濒危植物，1999年被列为我国一级珍稀濒危野生植物，是全世界公认的植物界“大熊猫”。东北红豆杉T.cuspidata与南方红豆杉T.chinensis、曼地亚红豆杉T.madia、云南红豆杉T.yunnanensis和密叶红豆杉T.fuana等其他红豆杉属植物的茎和叶型相似度非常高，尤其在幼苗期，利用形态学鉴别方法很难将东北红豆杉与其它四种红豆杉区分开，并且形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，仅靠形态差异难以准确鉴定。这也为东北红豆杉资源的鉴定、保护和利用带来了极大困难。因此，建立更为快速、准确鉴别东北红豆杉的方法是非常必要的。与传统形态学鉴定技术相比，DNA分子标记技术不受环境及基因表达与否的限制，该技术能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测。DNA分子标记数量多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，可以通过基因序列差异比较分析为植物鉴别、系统分类提供直接的证据。因此，DNA分子标记尤其是特异性分子标记技术弥补和克服了传统形态学鉴定方法的一些缺陷和难题，是传统形态学鉴定技术的高效辅助手段。本专利技术通过开发设计提供一种东北红豆杉的分子特异性标记引物，并建立其鉴别方法，为实现该珍贵红豆杉种质资源的真伪鉴别及保护提供技术支持。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是针对现有技术的不足，提供用于鉴别东北红豆杉T.cuspidata的分子特异性标记引物，该分子特异性标记引物序列如下：上游引物DHDSF：5’-GTGGACCTGAACAATGAA-3’，如SEQIDNO.1所示；下游引物DHDSR：5’-AAACACCGTGTGGAACTT-3’，如SEQIDNO.2所示；该分子特异性标记引物的开发过程：首先，采用常规PCR技术及琼脂糖凝胶电泳检测，以及经过大量DNA指纹图谱比较分析，筛选获得东北红豆杉的特异性DNA电泳位点。之后，经过切胶回收、TA克隆及测序分析，获得该特异性DNA序列(如SEQIDNO.3所示)，在此基础上，开发获得东北红豆杉的分子特异性标记引物(DHDSF/DHDSR)。以该分子特异性标记引物作为PCR扩增引物，对东北红豆杉及其相似近缘红豆杉物种(南方红豆杉T.chinensis、曼地亚红豆杉T.madia、云南红豆杉T.yunnanensis和密叶红豆杉T.fuana)样品进行PCR扩增。经电泳检测，该引物只与东北红豆杉样本DNA发生反应，获得486bp大小的特异性DNA片段，而与南方红豆杉T.chinensis、曼地亚红豆杉T.madia、云南红豆杉T.yunnanensis和密叶红豆杉T.fuana的样品材料不发生反应。为了验证该分子特异性标记引物(DHDSF/DHDSR)的稳定性和应用范围，利用该引物对来自12个不同东北红豆杉个体的样本基因组总DNA进行PCR扩增，结果所有东北红豆杉样品都能扩增出486bp大小的特异性DNA条带，说明本专利技术提供的特异性标记引物具有非常好的稳定性和应用范围。本专利技术的第二个目的是提供上述分子特异性标记引物对东北红豆杉进行鉴别的方法。采用上述分子特异性标记引物组合(DHDSF/DHDSR)作为特异性扩增引物，以被测东北红豆杉与其近缘相似红豆杉物种样品DNA为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳图谱中出现分子量为486bp大小的特异性DNA条带，则被测植物样品为东北红豆杉T.cuspidata，反之则不是。具体的所述方法如下：(1)样品基因组总DNA提取：剪取被测植物样品(东北红豆杉及其近缘相似红豆杉物种)叶片0.15g放入研钵，加液氮研磨至粉末，然后，利用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(订购于上海生工生物工程股份有限公司)提取被测植物样品的基因组DNA。所得DNA用1.0％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μL。(2)PCR扩增反应：以步骤(1)提取的被测植物样品DNA为模板，以本专利提供的分子特异性标记引物(DHDSF/DHDSR)作为扩增引物，进行PCR扩增。PCR反应体系(总体积25μL)：2.5μL的10×PCRBuffer[200mMTris–HCl(pH8.8)，100mMKCl，100mM(NH4)2SO4，20mMMgCl2，质量含量1％TritonX-100]，1μL的模板DNA(50ng/μL)，0.8μL的dNTPs(10mM)，1μL上游引物DHDSF(10μM)，1μL下游引物DHDSR(10μM)，0.5μL的Taq酶(2U/μL)，18.2μL的ddH2O。PCR反应程序：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸1.5min)；最后，72℃延伸10min。(3)电泳检测：利用1.5﹪琼脂糖凝胶对步骤(2)所得的PCR产物进行电泳检测。然后，利用凝胶成像系统(BIO-RADMolecularGelDocTMXR+SystemwithImageLabTMSoftware)进行拍照和DNA指纹图谱分析。若电泳图通道出现分子量为486bp大小的特异性DNA电泳条带，则被测植物样品为东北红豆杉，反之则不是。本专利技术主要有益效果表现为：DHDSF/DHDSR是东北红豆杉的种特异性PCR扩增引物。若被测植物样品为东北红豆杉，则PCR反应为阳性，DNA指纹图谱上会出现486bp大小的特异性DNA电泳条带；若被测植物样品为其他近缘相似物种的样品DNA，则PCR反应为阴性，DNA指纹图谱不会出现486bp大小的特异性DNA电泳条带。从而实现东北红豆杉种质资源的快速、准确鉴别，使用方法简便，操作耗时短。附图说明图1为利用本专利技术提供的分子特异性标记引物(DHDSF/DHDSR)对被测红豆杉属植物进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为Trans2KDNAMarker(北京全式金生物技术有限公司)；通道C：阴性对照；1～6：东北红豆杉；通道7～12：曼迪亚红豆杉；通道13～18：南方红豆杉；通道19～24：云南红豆杉；通道25～30：密叶红豆杉。电泳图显示只有东北红豆杉所有样品扩增出分子量为486bp大小的特异性DNA条带。图2是本专利技术所述的东北红豆杉的特异性核苷酸序列，以及东北红豆杉特异本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种东北红豆杉的分子特异性标记引物，其特征在于，该特异性标记引物序列如下：上游引物DHDSF，如SEQ ID NO.1所示；下游引物DHDSR，如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种东北红豆杉的分子特异性标记引物，其特征在于，该特异性标记引物序列如下：上游引物DHDSF，如SEQIDNO.1所示；下游引物DHDSR，如SEQIDNO.2所示。2.利用权利要求1所述的一种东北红豆杉的分子特异性标记引物对东北红豆杉进行鉴别的方法，其特征在于，具体步骤如下，(1)提取被测红豆杉植物样品的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的被测植物样品DNA为扩增模板，以所述分子特异性标记引物DHDSF/DHDSR作为扩增引物，进行PCR扩增；(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果出现486bp大小的特异性DNA片段，则被测植物样品为东北红豆杉，反之则不...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈晨佳，冯尚国，罗秀俊，俞春娜，王慧中，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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