融合蛋白hBD2-haFGF1及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种融合蛋白hBD2‑haFGF1及其制备方法和应用。本发明专利技术提供的融合蛋白是以人肝癌细胞HepG2cDNA为模板，分别扩增hBD‑2基因和haFGF‑1基因，然后采用SOE‑PCR的方法构建hBD2‑haFGF1融合基因，并诱导该基因在体外表达形成的，而且成功构建了hBD2‑haFGF1/pET21b原核表达载体。本发明专利技术提供的融合蛋白，hBD2‑haFGF1是一个不稳定的亲水性蛋白，具有良好的热稳定性，可用于制备新型痤疮药物，为进一步的蛋白分离纯化和药理活性研究提供了基础。

Fusion protein hBD2-haFGF1 and its preparation and Application

The invention belongs to the field of biomedical technology, in particular to a fusion protein hBD2 haFGF1 and its preparation method and application. The fusion protein provided by the invention is based on human hepatocellular carcinoma cell HepG2 gene as template, respectively amplifying hBD 2 gene and haFGF 1 gene, then using SOE PCR method to construct hBD2 haFGF1 fusion gene, and induce the gene expression in vitro, and successfully constructed the prokaryotic expression vector of hBD2 haFGF1/pET21b. The fusion protein hBD2 haFGF1 provided by the invention is an unstable hydrophilic protein with good thermal stability, and can be used to prepare new acne drugs, providing a basis for further protein separation, purification and pharmacological activity research.

【技术实现步骤摘要】
融合蛋白hBD2-haFGF1及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种融合蛋白hBD2-haFGF1及其制备方法和应用。
技术介绍
人β防卫素-2(humanβdefensin-2,hBD-2)是一种来源于皮肤、呼吸道等上皮组织的阳离子抗菌肽。hBD-2在皮肤天然免疫中发挥了重要的作用，当皮肤发生细菌感染或者炎症时，可通过NF-κb通路和丝裂原活化蛋白激酶途径活化，使hBD-2的表达水平显著升高，hBD-2可通过直接杀灭病原菌和参与获得性免疫应答发挥抗菌功能。由于hBD-2具有抗菌活性和免疫调节功能，可通过直接与细菌细胞膜结合，破坏细胞膜完整性，从而导致菌体死亡，还可趋化树突状细胞和记忆T细胞，提高机体获得性免疫水平。在痤疮病损部位，P.acnes为hBD-2的主要诱导源，P.acnes可刺激皮脂腺细胞产生抗菌肽和hBD-2。haFGF和碱性成纤维因子(bFGF)均可用于痤疮的治疗，如与点阵铒激光、微晶磨面等技术相结合，促进痤疮患者瘢痕创面的愈合，下调Ⅰ型前胶原基因的表达，减少I型胶原、III型胶原、TGF-β1、VEGF的含量。酸性成纤维细胞生长因子(humanacidicfibroblastgrowthfactors,haFGF)是成纤维细胞生长因子家族成员之一。haFGF具有广泛的生物学作用，能诱导多种细胞分化、增殖、营养和保护神经元，促进伤口修复，诱导缺血区血管形成。研究发现haFGF-1对创伤、糖尿病溃疡等多种皮肤损伤都有良好的促愈合作用。相对于hbFGF，haFGF结合能力更强，更适合创面酸性环境，更为温和持久的生物学活性，在痤疮中可取得更佳的治疗效果。痤疮是一种常见的毛囊、皮脂腺慢性炎症疾病，其发病主要与痤疮丙酸杆菌(P.acnes)、皮脂腺导管的角化、皮脂大量分泌、炎症因子产生有关[6]。痤疮的治疗以抗菌、抗角化、抗雄性激素和抑制瘢痕形成为主[7]。痤疮是一种自限性疾病，临床治疗过程中应避免使用副作用大的药物，同时严重痤疮如果得不到妥善治疗，痤疮导致的色素沉着和较大的瘢痕往往难以修复，极大的影响患者的美观和心理健康，为此开发新型抗痤疮药物有其现实意义。生物信息学是世纪80年代兴起的一门交叉学科，是以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学，可用于对蛋白质结构及功能的分析。融合基因，是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下，构成的嵌合基因。融合基因的表达产物为融合蛋白。根据构成融合基因的种类，可以将融合基因分为四大类：(1)由报告基因和功能基因构成的融合基因。常用的报告基因有：GFP(绿色荧光蛋白)基因、GUS基因、LacZ基因和Luciferasese(虫荧光素酶)基因等，主要目的是对功能基因进行示踪，研究其功能及特性。(2)由信号肽或单体蛋白的序列与功能基因构成的融合基因。其主要目的是利用信号肽或单体序列携带目的基因高效表达，从而提取纯化目的蛋白，为生产或科研所用。(3)功能基因与功能基因的融合。可分为两类：A相同功能基因的融合，目的是增强基因的功能，扩大基因的应用范围，如杀虫基因之间的融合。B.不同功能基因的融合，为特殊需要而构建，如生产无毒疫苗等。(4)报告基因与抗药性基因的融合用于构建融合载体，以利于插入大片段的cDNA或作为双功能标记。但是，随着融合基因的广泛应用，其缺陷也越来越多，经常会出现融合蛋白不稳定，治疗效果不显著等问题。中国专利申请CN102137869B公开了一种Fn14/TRAIL融合蛋白，所述Fn14/TRAIL融合蛋白包括第一结构域及第二结构域，可用于制备药物组合物，也可用在治疗或改善患有自身免疫病的患者中同种免疫性疾病的方法中。但是，该融合蛋白Fn14/TRAIL只包含两个结构域，无连接子连接，导致该融合蛋白不稳定，治疗效果不显著。综上可知，现有技术中的融合蛋白存在不稳定，功能效果低于单一蛋白的缺点。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺点，本专利技术的目的是提供一种融合蛋白hBD2-haFGF1及其制备方法和应用。本专利技术提供的融合蛋白hBD2-haFGF1，具有连接子，融合后的蛋白质是一个亲水性蛋白，热稳定性强，经生物信息学验证，其理化性质稳定，可以有效用于制备痤疮相关药物。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种融合蛋白hBD2-haFGF1，由第一结构域及第二结构域通过连接子构成，所述第一结构域为β-防御素的保守结构域，所述第二结构域为成纤维细胞生长因子超家族保守结构域。优选地，所述融合蛋白hBD2-haFGF1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述连接子的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。MetAlaSerMetThrGlyGlyGlnGlnMetGlyArgGlySerGluPheGlyIleGlyAspProValThrCysLeuLysSerGlyAlaIleCysHisProValPheCysProArgArgTyrLysGlnIleGlyThrCysGlyLeuProGlyThrLysCysCysLysLysProGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerPheAsnLeuProProGlyAsnTyrLysLysProLysLeuLeuTyrCysSerAsnGlyGlyHisPheLeuArgIleLeuProAspGlyThrValAspGlyThrArgAspArgSerAspGlnHisIleGlnLeuGlnLeuSerAlaGluSerValGlyGluValTyrIleLysSerThrGluThrGlyGlnTyrLeuAlaMetAspThrAspGlyLeuLeuTyrGlySerGlnThrProAsnGluGluCysLeuPheLeuGluArgLeuGluGluAsnHisTyrAsnThrTyrIleSerLysLysHisAlaGluLysAsnTrpPheValGlyLeuLysLysAsnGlySerCysLysArgGlyProArgThrHisTyrGlyGlnLysAlaIleLeuPheLeuProLeuProValSerSerAspLeuGluHisHisHisHisHisHis(SEQIDNO.1)；GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer(SEQIDNO.2)。优选地，所述融合蛋白hBD2-haFGF1的表达基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCCGAATTCAGGTATAGGCGATCCTGTTACCTGCCTTAAGAGTGGAGCCATATGTCATCCAGTCTTTTGCCCTAGAAGGTATAAACAAATTGGCACCTGTGGTCTCCCTGGAACAAAATGCTGCAAAAAGCCAGGCGGAGGCGGAAGCGGAGGCGGAGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCTTTAATCTGCCTCCAGGGAATTACAAGAAGCCCAAACTCCTCTACTGTAGCA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白hBD2‑haFGF1，其特征在于，由第一结构域及第二结构域通过连接子构成，所述第一结构域为β‑防御素的保守结构域，所述第二结构域为成纤维细胞生长因子超家族保守结构域。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白hBD2-haFGF1，其特征在于，由第一结构域及第二结构域通过连接子构成，所述第一结构域为β-防御素的保守结构域，所述第二结构域为成纤维细胞生长因子超家族保守结构域。2.如权利要求1所述的融合蛋白hBD2-haFGF1，其特征在于，所述融合蛋白hBD2-haFGF1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述连接子的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种编码权利要求1所述的融合蛋白hBD2-haFGF1的表达基因，其特征在于，所述融合蛋白hBD2-haFGF1的表达基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.一种如权利要求1所述的融合蛋白hBD2-haFGF1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、根据hBD-2基因序列和haFGF-1基因序列分别设计PCR引物，其中，hBD-2基因引物的序列信息如SEQIDNO.4，SEQIDNO.5所示，haFGF-1基因引物的序列信息如SEQIDNO.6，SEQIDNO.7所示，然后进行PCR扩增，得hBD-2基因和haFGF-1基因；S2、以步骤S1所得hBD-2基因和haFGF-1基因为模板，另设计引物，其中，hBD-2基因引物序列信息如SEQIDNO.8，SEQIDNO.9所示，haFGF-1基因引物序列信息如SEQIDNO.10，SEQIDNO.11所示，然后进行PCR扩增，得高度保守的hBD-2基因连接片段和haFGF-1基因连接片段；S3、以步骤S2所得高度保守的hBD-2基因连接片段和haFGF-1基因连接片段为模板，进行PCR扩增，得hBD2-haFGF1融合基因；S4、在步骤S3所得hBD2-haFGF1融合基因的F端引入EcoRI酶切位点，在R端引入XhoI酶切位点，对hBD2-haFGF1融合基因及pET21b质粒进行双酶切，插入pET21b质粒，构建hBD2-haFGF1基因和pET21bT4连接体系，得重组质粒hBD2-haFGF1/pET21b；S5、将步骤S4所得重组质粒hBD2-haFGF1/pET21b转化入DH-5α菌中，接种于氨苄青霉素抗性的L...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文彬，王晖，姜盛颉，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44