一种具有抗肿瘤作用的融合蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有抗肿瘤作用的融合蛋白及其编码基因与应用，其目的是提供一种具有抗肿瘤作用的融合蛋白及其编码基因与以该融合蛋白为活性成分的预防和／或治疗由人乳头瘤病毒感染引起的肿瘤疫苗。该融合蛋白是具有序列表中的ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：５的氨基酸残基序列的蛋白质或是将序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：５的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗肿瘤作用的蛋白质。本发明专利技术的具有减肥作用的融合蛋白可作为预防和／或治疗由人乳头瘤病毒感染引起的适应症，特别是宫颈癌、宫内上皮瘤样病变、肛门发育不全疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种具有抗肿瘤作用的融合蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种具有抗肿瘤作用的融合蛋白及其编码基因与以该融合蛋白为活性成分的预防和/或治疗由人乳头瘤病毒感染引起的肿瘤疫苗。
技术介绍
人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)属乳多孔病毒科A亚组，是异族主要侵犯人体皮肤粘膜的小DNA病毒，引起上皮的增生改变，具有明显的组织特异性。按照HPV感染与子宫颈癌发生的危险性，将HPV分为低危型(HPV1、5、6、11等)和高危型(HPV16、18、31、33、45等)。低危型HPV可引起表皮细胞良性增生，如乳头状瘤或疣；高危型HPV与子宫颈上皮内瘤的发生和恶变以及其它上皮型肿瘤的发生相关。其中HPV16与子宫颈癌的关系最为密切，在所有子宫颈癌标本中HPV16的检出率在50％以上。根据核苷酸序列进行分型，现已鉴定出的HPV有100多个亚型。HPV病毒体直径约55nm，为二十面体对称结构，有外膜包被。其基因组是一闭环双链DNA，属双链DNA病毒，长约8Kb，分早期区、晚期区和调节区。早期区(early region，ER)包括6个不同的开放阅读框E1、2、4-7。E1通过与DNA多聚酶α结合启动DNA复制。E2蛋白质是一个转录激活调节因子，有DNA结合特性。E4蛋白可能与病毒颗粒释放有关，E5编码一种疏水的膜蛋白，是血小板生长因子/表皮生长因子受体激活因子，具有一定转化潜能。E6、E7编码的蛋白有细胞转化功能，是高危型HPV致癌作用的主要蛋白质。体内体外研究表明他们有致肿瘤活性，主要表现在高危型HPV的E6、E7蛋白可使原代细胞永生化；抑制细胞终末分化；影响细胞周期调控；以及E6或E7蛋白质转化的永生化细胞在裸鼠体内能形成肿瘤。E6基因编码的E6蛋白可与细胞P53蛋白结合而发挥转化功能，E6蛋白质与P53蛋白质结合后，加速P53蛋白质的降解，使之丧失“分子警察”的功能，失去抑癌活性；E7蛋白通过与抑癌基因产物Rb蛋白结合，从而影响Rb与转录因子E2F的结合，与Rb分离状态下的E2F对细胞有转录激活作用，能刺激细胞增殖。E6或E7蛋白质的单独作用已具有一定的转化功能，但两者的协同作用可极大地提高转化频率。HPV感染与人体多种癌症，尤其是子宫颈癌的发病有关。不同型别HPV感染不同的上皮组织，引起的病理变化也不同，对身体不同部位的皮肤和粘膜的嗜向性不同，即HPV感染有明显的组织特异性。根据所感染上皮的不同，将HPV分为皮肤型和粘膜型，并将前者进一步分为寻常疣和疣状表皮结构不良两种类型。粘膜型HPV感染下生殖道或下泌尿道粘膜上皮，感染口腔和呼吸道粘膜者较少。按照与生殖道肿瘤的关系，将之分为低危型和高危型，低危型(HPV6、11)引起生殖道乳头状疣或尖锐湿疣的形成；高危型(HPV16、18、33)引起子宫颈上皮内瘤，并进而与子宫颈癌的发生有关。HPV16至今还不能在体外组织中培养，且含有潜在致癌性DNA，故疫苗不能采用HPV减毒活疫苗或灭活疫苗。因此现在疫苗的研究重点在其他形式的疫苗，如基于晚期蛋白L1的亚单位疫苗、合成多肽疫苗、DNA重组活疫苗和DNA疫苗等。(一)病毒样颗粒HPV病毒体诱发的抗体，尤其是中和抗体，只能识别构象依赖性表位，因此不能用它们作为抗原和免疫原进行HPV16的抗体检测或制备疫苗。HPV16的L1和L2基因编码病毒衣壳蛋白，与病毒的侵袭性感染有关而无转化活性。最初利用大肠杆菌表达的L1和L2蛋白只能形成线性表位，缺乏翻译后修饰，用血清学检测时结果缺乏特异性，也不与病情相关，免疫学研究证明所诱发的抗体滴度低，不能形成有效保护。用沙门氏菌表达的L1和L2蛋白能装配成病毒样颗粒(virus like particle，VLP)，可诱发高滴度抗体。与原核表达系统相比，真核系统表达的晚期蛋白更具有天然蛋白质的免疫原性。动物试验表明，用VLP免疫动物可产生有效的保护作用。此疫苗正在进行临床试验。(二)DNA重组活疫苗DNA重组活疫苗的优势在于能使感染细胞内源性表达目的基因，有正确的翻译后修饰加工作用。痘苗病毒是最有吸引力的侯选表达载体，它对外源DNA容量大，可诱导宿主产生体液和细胞免疫反应。HPV16L1重组痘苗病毒可以刺激小鼠产生CTL反应，但它会引起免疫缺陷者的种痘后脑炎或进行性牛痘等副作用。腺病毒作为载体的毒性相对较小，经鼻腔免疫后可刺激肺和生殖道中IgA抗体分泌，这对HPV这种生殖道感染疾病具有吸引力，但临床试验并非预期的那样好。(三)合成多肽疫苗安全性好，容易制备和储存，有理想的靶特异性。但制备多肽疫苗的前提是明确抗原的决定簇结构。至今HPV16的中和表位和T细胞表位尚未完全确定，因此这种方式还有一定难度。(四)DNA疫苗DNA疫苗具有纯化技术简单、制备迅速、成本低廉、易于储存等特点。接种DNA疫苗后蛋白质在宿主细胞内表达，直接与主要组织相容性复合体MHC I类或II类分子结合，同时引起细胞和体液免疫，免疫应答全面，保护力强，维持时间久；尤其是在宿主细胞内表达的蛋白质抗原与其自然感染相似，按正常途径加工、处理、修饰，并以天然构象递呈给宿主免疫系统，激发免疫应答。HPV16L1的核酸疫苗动物实验显示具有良好的效果，可以诱导小鼠产生对HPV16L1的特异性体液和细胞免疫。但DNA疫苗在临床试验中的效果并不理想，并且DNA疫苗的安全性还需要进一步深入研究。以上所介绍的各种HPV疫苗大多处于研究阶段，并且重点主要放在预防性疫苗上。其中效果最好的是病毒样颗粒，现正在进行临床试验。对于由HPV16感染引起的宫颈癌、宫颈上皮内瘤(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)等疾病这些预防性疫苗就会失去作用。针对这些疾病，需要开发相应的治疗性疫苗。高危型HPV16E7基因编码的蛋白质具有转化活性，在子宫颈癌组织中持续表达，被认为是病毒的癌基因，其表达的蛋白质被认为是肿瘤排斥抗原，因而是治疗HPV相关肿瘤和子宫颈癌高度特异型增生的最富有吸引力的靶抗原基因。以E7为基础开发疫苗的方法主要有三种(1)用细菌、酵母或昆虫细胞表达系统制备野生型E7的完整蛋白质作抗原；(2)将E7的完整或突变基因重组入不同的载体系统，如腺病毒、痘苗病毒、逆转录病毒，直接构建DNA疫苗；(3)E7蛋白的CTL表位多肽作为亚单位疫苗。现在已经知道，以上几种疫苗形式均可以激活体液或细胞免疫，但是本身都有其内在的缺点，如DNA疫苗，到目前为止国际上尚未有成熟产品上市；单独用E7蛋白的CTL表位多肽作为亚单位疫苗，疫苗的保护作用不能持久等。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一类在分子进化上高度保守、广泛存在于细菌、原虫、蠕虫、酵母菌、植物、动物乃至人类的家族蛋白，其功能极为相似，具有分子伴侣作用，参与多种胞内蛋白的折叠、装配及转运；近年来发现，病原体Hsp与病原体抗原表位相结合可以成为免疫优势抗原(immunodominantantigens)引起抗感染免疫；Hsp还可以作为肿瘤病毒疫苗的载体，诱导机体肿瘤特异性CTL反应，其研究策略是热休克蛋白和肿瘤特异性抗原肽融合表达，融合肽疫苗注射人体后可激活针对肿瘤细胞的特异性免疫反应。其理论基础是，本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有抗肿瘤作用的融合蛋白，是具有序列表中的ＳＥＱＩＤ№：５的氨基酸残基序列的蛋白质或是将序列表中ＳＥＱＩＤ№：５的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗肿瘤作用的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志敏，张士猛，赵洪亮，薛冲，张伟，黎明，熊向华，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：11[]