本发明专利技术提供了重组人肿瘤坏死治疗单抗（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏ ｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｒｈＴＮＴ）与白细胞介素２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ２，ＩＬ２）的融合蛋白（ｒｈＴＮＴ－ＩＬ２），编码该融合蛋白的ＤＮＡ序列，构建含该ＤＮＡ序列的真核细胞表达载体，筛选并保存稳定高表达该融合蛋白的宿主细胞株，纯化该融合蛋白的工艺方法，以及含该融合蛋白的药物组合物。该融合蛋白具有广谱抗肿瘤的治疗作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及DNA重组技术和药物领域。更具体地，本专利技术涉及肿瘤坏死治疗单抗(rhTNT)与人白细胞介素2(以下简称IL2)的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的工艺方法，以及该融合蛋白在治疗肿瘤等疾病中的应用。
技术介绍
目前的肿瘤治疗方案中最重要的是手术，化疗和放疗。这三大常规疗法尽管可以大大延长肿瘤病人的存活期，但是肿瘤患者仍然会因为复发或转移而死亡，或者因为化疗、放疗导致的骨髓抑制继发性发生感染或出血而死亡。为此，人们不断尝试各种生物疗法以弥补目前现存的治疗方法的不足，例如基因治疗、免疫治疗等。细胞因子(Cytokine)是是一类由机体的活化免疫细胞或其他细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白质的统称，具有调节细胞生理功能、介导炎症反应、参与免疫应答和组织修复等多种生物学效应。根据细胞因子的功能又分为如白细胞介素(Interleukin，IL)，集落刺激因子(Colony-stimulatingFactor，CSF)，干扰素(Interferon)，肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)等等。由于细胞因子对免疫功能具有调节作用，局部应用可以增强肿瘤的免疫原性，因而作为药物应用治疗肿瘤疾病。这些细胞因子在市场上都销售多年并显示出独特的治疗效果，其缺点是在体内半衰期短、缺乏特异性。IL-2作为一种具有广泛的临床应用价值的基因工程产品，可提高人体对肿瘤的免疫应答，是机体抗肿瘤免疫应答中最重要的因子之一，目前除了上市用来治疗黑色素瘤和肾癌外，正在进行各期临床试验治疗其他不同类型的恶性肿瘤。表达IL-2的肿瘤疫苗、重组病毒等基因治疗或生物治疗产品也正在进行临床试验。基因工程IL-2目前主要的给药途径全身给药，全身使用IL-2的缺点是缺乏肿瘤特异性且容易导致严重毒副作用，如毛细血管渗漏综合症，给病人带来痛苦甚至危及生命。单克隆抗体是近年来生物
发展最快的技术之一，从1975年Melstein和Kohler专利技术鼠源性单克隆抗体，至今近30多年时间里，抗体经历了鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体四个里程碑。由于单抗独特灵活的作用机理使得它既可以发挥信号传导的拮抗作用或发挥ADCC作用直接杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖或者引起肿瘤细胞凋亡，也可以作为肿瘤特异性运输工具，将放射性核素如131I和90Y、毒素或化学药物运输到肿瘤部位，发挥特异性治疗作用。其中，鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体这三类抗体由于或多或少含有鼠源蛋白成分，进入人体可以引起HAMA或HACA反应，影响治疗效果并可能导致严重的不良反应。然而，迄今为止尚没有将肿瘤特异性抗体(尤其是全人抗体)与白细胞介素2融合形成高特异性和高肿瘤杀伤力的融合蛋白。因此，为了更有效的治疗肿瘤病人，尤其是传统治疗方式无能为力的病人，本领域迫切需要开发兼具肿瘤特异性抗体和IL2两者生物活性的药物。
技术实现思路
本专利技术的一个目的就是提供一种新的具有肿瘤特异性抗体和IL2两者生物活性的药物，它是rhTNT和IL2的融合蛋白。本专利技术的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。本专利技术的另一目的是提供一种成本低廉和/或步骤简便的生产所述rhTNT-IL2融合蛋白的方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种融合蛋白，它包括(a)肿瘤坏死治疗单抗元件，该肿瘤坏死治疗单抗元件由抗体重链和抗体轻链通过二硫键连接形成，其中所述的抗体重链的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO1、2和3；(b)白细胞介素2元件，该元件具有全长人白细胞介素2或其活性片段的氨基酸序列；以及(c)位于肿瘤坏死治疗单抗元件中抗体重链和白细胞介素2元件之间的1-20个氨基酸的连接肽序列。在另一优选例中，所述的抗体轻链的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO5、6和7；所述的全长人白细胞介素2具有SEQ ID NO11中第1-133位氨基酸序列，人白细胞介素2活性片段具有SEQ ID NO11中第22-58位氨基酸序列；所述的接头肽序列含3-10个氨基酸。更佳地，所述的融合蛋白中的抗体部分重链的可变区具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；轻链的可变区具有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述融合蛋白是由保藏号为CCTCC C200406的小鼠骨髓瘤细胞株NSO-TNTIL2产生的。在另一优选例中，所述的抗体重链和抗体轻链为IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚类。在另一优选例中，且连接肽位于抗体重链的羧基端和白细胞介素2元件的氨基酸之间。在本专利技术的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本专利技术上述的融合蛋白。在本专利技术的第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体和含有上述载体的宿主细胞。在本专利技术的第四方面，提供了一种产生本专利技术融合蛋白的方法，它包括步骤在表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。在本专利技术的第五方面，提供了一种药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的(如0.001-99.99wt％)本专利技术的融合蛋白。较佳地，所述融合蛋白的含量是组合物总重量的0.01-99.9％。在另一优选例中，所述的药物组合物还含有选自下组的抗肿瘤药物顺铂、5-Fu、氨甲蝶呤、IFN、TNF、氮芥、环磷酰胺、阿霉素、放线菌素D、长春新碱、喜树碱类或其组合。在本专利技术的第六方面，提供了本专利技术融合蛋白的用途，它被用于制备治疗肿瘤的药物，尤其是用于制备治疗恶性实体瘤的药物。在本专利技术的第七方面，提供了一种融合多肽，所述的融合多肽实际上是上述融合蛋白中的融合重链，它包括(a)肿瘤坏死治疗单抗的重链元件，所述抗体重链元件的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO1、2和3；(b)白细胞介素2元件，该元件具有全长人白细胞介素2或其活性片段的氨基酸序列；以及(c)位于肿瘤坏死治疗单抗元件中抗体重链和白细胞介素2元件之间的1-20个氨基酸的连接肽序列。在本专利技术的第八方面，还提供了一种化合物，它由本专利技术上述融合蛋白以及与所述融合蛋白偶联的PEG构成。较佳地，PEG的分子量是5-100KD，更佳地为40-80KD。融合蛋白与PEG的摩尔比为1∶0.5-1∶10，更佳地为1∶1-1∶5。附图说明图1显示了表达rhTNT-IL2融合蛋白的制备示意图。图2显示了rhTNT-IL2融合蛋白的IL2比活性。图3显示了rhTNT-IL2融合蛋白针对肿瘤的特异结合性。图4显示了对3个批次的还原型rhTNT-IL2融合蛋白的SDS-PAGE检测结果。其中，泳道1Marker；泳道2还原型；泳道3还原型；泳道4还原型。图5显示了对3个批次的非还原型rhTNT-IL2融合蛋白的SDS-PAGE检测结果。其中，泳道1Marker，泳道2非还原型、泳道3非还原型、泳道4非还原型。具体实施例方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，将肿瘤坏死治疗单抗rhTNT基因和IL2基因融合在一起，产生由合适的氨基酸连接臂连接的rhTNT-IL2的融合蛋白。所述融合蛋白具有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，它包括：（ａ）肿瘤坏死治疗单抗元件，该肿瘤坏死治疗单抗元件由抗体重链和抗体轻链通过二硫键连接形成，其中所述的抗体重链的ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、和ＣＤＲ３的氨基酸序列分别为ＳＥＱＩＤＮＯ：１、２和３； （ｂ）白细胞介素２元件，该元件具有全长人白细胞介素２或其活性片段的氨基酸序列；以及（ｃ）位于肿瘤坏死治疗单抗元件中抗体重链和白细胞介素２元件之间的１－２０个氨基酸的连接肽序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：鞠佃文，陶群，叶丹，张昕泂，傅清，
申请(专利权)人：上海美恩生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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