一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用制造技术

本发明专利技术提供一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用。具体的，本发明专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有式I所示的结构：Z1‑L1‑Z2‑L2‑Z3(I)其中，Z1为无或信号肽元件；L1为无或连接肽；Z2为TRAG‑3蛋白；L2为无或连接肽；Z3为LAMP‑1蛋白的跨膜区和胞内区。本发明专利技术的融合蛋白可将TRAG‑3抗原表位负载到树突状细胞中，促使树突状细胞能更好的将TRAG‑3抗原提呈，激发更强的抗原特异性的T细胞免疫反应，从而使得树突状细胞具有更好的肿瘤，尤其是TRAG‑3阳性肿瘤的杀伤活性。

Preparation and Application of a Gene Modified Dendritic Cell Vaccine

The invention provides a preparation and application of a gene modified dendritic cell vaccine. Specifically, the present invention provides a fusion protein with the structure shown in Formula I: Z1 L1 Z2 L2 Z3 (I), in which Z1 is a non-or signal peptide element; L1 is a non-or connective peptide; Z2 is a TRAG 3 protein; L2 is a non-or connective peptide; and Z3 is a transmembrane and intracellular region of LAMP 1 protein. The fusion protein of the present invention can load the antigen epitope of TRAG 3 into dendritic cells, so that the dendritic cells can better present the antigen of TRAG 3, stimulate stronger antigen specific T cell immune response, and thus make the dendritic cells have better killing activity of tumors, especially those with TRAG 3 positive.

【技术实现步骤摘要】
一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用
本专利技术涉及生物学和医学领域，更具体地，本专利技术涉及一种基因修饰的树突状细胞疫苗的制备及应用。
技术介绍
肿瘤是继心脑血管疾病成为人类健康的第二大杀手，传统的肿瘤治疗方法主要是手术治疗、放疗及化疗等。传统的治疗手段不能很好的解决肿瘤迁移及再次复发的难题，目前新型肿瘤治疗方法—免疫疗法是肿瘤治疗及预防最具潜力的一种方法。肿瘤免疫疗法包括很多种例如Car-T、TCR-T及树突状细胞疫苗等，在临床上取得了良好的疗效。其中Car-T等免疫疗法在实体瘤中治疗效果并不理想，还存在很强的毒副作用。基于树突状细胞疫苗进行的肿瘤免疫治疗临床上也取得了良好的疗效，例如：黑色素瘤、前列腺癌等。DC疫苗具有毒副作用小，安全性高，针对肿瘤靶向性良好的一种免疫疗法。树突状细胞(DC：dendriticcell)是一类专职性抗原提呈细胞，具有起始并调控固有免疫及适应性免疫反应的能力，能高效摄取、加工处理和提呈抗原。树突状细胞未受到抗原刺激时处于未成熟状态，接受抗原刺激后树突状细胞能够快速成熟活化并(将抗原提呈至T细胞)，经淋巴系统迁移至次级淋巴器官，将抗原提呈至T细胞，促使T细胞活化引起机体T细胞免疫应答。根据树突状细胞表面分子不同，人体内主要存在三类树突状细胞：CD303(pDC浆细胞样树突状细胞)、CD1c及CD141树突状细胞。其中CD1c和CD141树突状细胞能够分泌IL-12，促进Th1细胞的生成并刺激初始CD8+T细胞的活化。虽然，树突状细胞疫苗在肿瘤免疫治疗中取得一些进展，但树突状细胞疫苗治疗肿瘤仍具有很大的局限性。一方面是因为部分肿瘤抗原免疫原性较低，无法很好的激活机体内肿瘤特异性免疫反应。另一方面，由于机体内肿瘤微环境所产生的免疫抑制功能阻碍树突状细胞疫苗在机体内发挥正常功能。肿瘤抗原主要包括：肿瘤相关抗原、病毒相关抗原、癌睾抗原及新抗原等。其中癌睾抗原(Cancer-testisAntigen,CT)是表达在多种肿瘤组织中、睾丸、胎盘及卵巢中的一类蛋白分子，不表达在其他任何组织中的一类抗原。癌睾抗原也是目前相对于肿瘤相关抗原免疫原性较高的一类抗原，能够有希望作为靶点治疗肿瘤疾病。至今已经筛选出250多个CT抗原成员，其中临床应用较多的主要有：MAGE和NY-ESO-1等。TRAG-3也是癌睾抗原中的一种，最初是在卵巢癌细胞中发现，该蛋白可以抵抗紫杉醇对细胞的胁迫作用。研究发现TRAG-3高表达在多种实体瘤中，包括78％黑色素瘤、54％非小型细胞肺癌及60％乳腺癌中等。因此，该蛋白作为肿瘤细胞治疗的靶点具有重大的潜在研究价值。目前，临床上制备树突状细胞疫苗主要是将人外周血单核细胞分离，体外利用GM-CSF及IL-4诱导单核细胞分化成树突状细胞。随后采用小分子抗原肽、腺病毒包装载体、慢病毒包装载体及肿瘤溶解物等致敏DC，制备成树突状细胞疫苗。由于不同的抗原其免疫原性强弱不同，临床上还可以通过加入不同的免疫佐剂来提高其活化程度。因此，本领域迫切需要开发有效的TRAG-3阳性肿瘤的预防性和/或治疗性疫苗。
技术实现思路
本专利技术的一个目的就是提供一种有效的TRAG-3阳性肿瘤的预防性和/或治疗性疫苗。本专利技术的另一目的在于提供一种靶向TRAG-3抗原修饰的树突状细胞疫苗，主要针对TRAG-3抗原阳性肿瘤的治疗。利用慢病毒感染树突状细胞的方法将TRAG-3抗原表位负载到树突状细胞中。本专利技术的另一目的在于，促使树突状细胞能更好的将TRAG-3抗原提呈。在本专利技术的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有式I所示的结构：Z1-L1-Z2-L2-Z3(I)其中，Z1为无或信号肽元件；L1为无或连接肽；Z2为TRAG-3蛋白；L2为无或连接肽；Z3为LAMP-1蛋白的跨膜区和胞内区；各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。在另一优选例中，所述Z1为含有SEQIDNO.:4所示的核心序列的多肽。在另一优选例中，所述Z1的氨基酸序列如SEQIDNO.:4所示。在另一优选例中，所述TRAG-3蛋白为TRAG-3全长蛋白、TRAG-3蛋白的活性片段、突变体、衍生物或类似物。在另一优选例中，所述TRAG-3蛋白活性片段、突变体、衍生物或类似物具有TRAG-3的功能或活性。在另一优选例中，所述TRAG-3蛋白选自下组：(A)具有SEQIDNO:5所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO:5所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥85％，优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)的多肽，且所述多肽具有TRAG-3蛋白的活性；(C)将SEQIDNO:5所示氨基酸序列经过1-15个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有TRAG-3蛋白活性的衍生多肽。在另一优选例中，所述TRAG-3蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:5所示。在另一优选例中，所述LAMP-1蛋白的跨膜区和胞内区如SEQIDNO.:6所示。在另一优选例中，所述的连接肽序列长度为1-20个氨基酸，较佳地1-10个氨基酸，更佳地，2-6个氨基酸。在另一优选例中，所述连接肽为具有n个重复的如SEQIDNO.:7(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)所示的序列，其中n为1-3，较佳地，n为1-2。在另一优选例中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.:7所示。在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:8所示。本专利技术第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本专利技术第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列。在另一优选例中，所述的DNA序列选自下组：基因组序列、cDNA序列。在另一优选例中，所述多核苷酸具有式II所示的结构：A1-S1-A2-S2-A3(II)其中，A1为无或信号肽元件的编码序列；S1为无或连接序列；A2为TRAG-3蛋白的编码序列；S2为无或连接序列；A3为LAMP-1蛋白的跨膜区和胞内区的编码序列；各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；在另一优选例中，所述信号肽元件的编码序列如SEQIDNO.:2所示。在另一优选例中，所述TRAG-3蛋白的编码序列选自下组：(a)编码如SEQIDNO.:5所示多肽的多核苷酸；(b)序列如SEQIDNO.:1所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与SEQIDNO.:1所示序列的同源性≥30％，较佳地，75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％或≥98％或≥99％)的多核苷酸；(d)在SEQIDNO.:1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述TRAG-3蛋白的编码序列如SEQIDNO.:1所示。在另一优选例中，所述LAMP-1蛋白的跨膜区和胞内区的编码序列如SEQIDNO.:3所示。在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：(a)编码如SEQIDNO.:8所示多肽的多核苷酸；(b)序列如SEQIDNO.:9所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与SEQIDNO.:9所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且编码SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有式I所示的结构：Z1‑L1‑Z2‑L2‑Z3  (I)其中，Z1为无或信号肽元件；L1为无或连接肽；Z2为TRAG‑3蛋白；L2为无或连接肽；Z3为LAMP‑1蛋白的跨膜区和胞内区；各“‑”独立地为连接肽或肽键或非肽键。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有式I所示的结构：Z1-L1-Z2-L2-Z3(I)其中，Z1为无或信号肽元件；L1为无或连接肽；Z2为TRAG-3蛋白；L2为无或连接肽；Z3为LAMP-1蛋白的跨膜区和胞内区；各“-”独立地为连接肽或肽键或非肽键。2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。3.一种载体，其特征在于，包括权利要求2所述的多核苷酸。4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。5.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养本权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所述的融合蛋白；和分离所述的融合蛋白。6.一种权利要求1所述融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗肿瘤的疫苗药物。7.一种树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞为用权利要求1所述的融合蛋白活化的树突状细胞。8.一种TRAG-3阳性肿瘤预防性或治疗性疫苗，其特征在于，含有安全有效量权利要求7所述的树突状...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晨蔚，李世强，
申请(专利权)人：上海尚泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31