一种靶向肿瘤多种KRAS突变抗原表位的细胞毒性T淋巴细胞的制备方法技术

本发明专利技术涉及靶向多种KRAS突变抗原表位的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法。本发明专利技术方法将7个主要KRAS突变抗原表位序列经串联组合而成的新的人工抗原编码序列，克隆到慢病毒表达载体，转染DC，刺激激活CD8+T细胞的增殖和分化，使得最终制备得到的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)具有靶向7个主要KRAS突变抗原表位的特异性。本发明专利技术制备的KRAS突变抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，具有靶向特异性强、无副作用和不易引起免疫逃逸等优点，在KRAS突变肿瘤的治疗中具有极大的应用前景。

Preparation of cytotoxic T lymphocytes targeting multiple KRAS mutant epitopes of tumors

【技术实现步骤摘要】
一种靶向肿瘤多种KRAS突变抗原表位的细胞毒性T淋巴细胞的制备方法
本专利技术涉及生物技术开发与应用研究领域，具体涉及靶向多种KRAS突变抗原表位的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法。
技术介绍
KRAS属于RAS基因家族重要成员，是细胞内信号传导通路中重要的“分子开关”，在MAPK(RAS-RAF-MEK-ERK)和PI3K(PI3K-AKT-mTOR)信号传导通路中起重要的调控作用，参与一系列基本的生物过程，包括细胞增殖、生存和分化(Janciketal.，2010)。但当KRAS发生突变时，其不能被水解酶水解失活，而处于持续激活状态，致使下游信号持续转导，从而造成细胞过度生长、增殖，并促发人类多种致死性肿瘤。时至今日，KRAS突变已存在于大约30％的人类癌症中，其中在多个癌症中有常态化趋势，特别是胰腺癌、结直肠癌和肺癌，其突变率分别高达90％、45％和35％。KRAS被激活最常见的方式为基因点突变，多发生在第12、13、61和146号密码子，常见突变位点为12和13号密码子，其中7个突变热点：G12D、G12V、G13D、G12C、G12A、G12S和G12R，依次分别为突变概率最高的热点，占所有KRAS突变的98.5％以上(Prioretal.，2012)。大量临床结果发现，KRAS突变对多种恶性肿瘤患者预后不利，例如KRAS突变会导致肺癌靶向药物EGFR-TKIs类发生原发耐药，同时也会导致结直肠癌患者对靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗的预后变差。相比于KRAS野生型的患者，KRAS突变的患者生存期明显缩短(Janciketal.，2010)。目前已知的RAS基因家族共有三个基因KRAS、NRAS和HRAS在人类肿瘤中存在突变，其中KRAS突变最为常见，约占85％左右。RAS基因突变，已成为目前世界上最难对付的基因突变。RAS作为一个非常重要的原癌基因，其实是一个非常理想的药物靶点。然而，目前针对该基因还没有行之有效的靶向药物。曾经多个RAS靶向药物都相继失败了，相比于EGFR抑制剂已经开发到第四代，RAS到目前为止还没看到有希望的靶向药被批准上市。其中一个最主要原因在于对RAS的功能以及RAS突变致癌的机理目前仍然没有完全阐明清楚，另外想要设计和开发出一种针对所有RAS突变都有效的药物也几乎是不可能的，因此，只能寻找针对特定突变的靶向药物，但这仍将任重而道远。肿瘤细胞免疫治疗已经成为目前肿瘤治疗研究的热点，并逐渐被认为是一种行之有效的治疗方法。免疫治疗通过触发机体免疫系统，对肿瘤相关抗原(TAAs)产生反应并攻击肿瘤细胞，是肿瘤治疗领域最有前景的治疗方法，成为继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗策略。针对KRAS突变的肿瘤，近期多项免疫治疗技术，包括免疫检查点抑制剂(PD1和PDL1)和TCR-T都取得了惊喜的临床试验结果。其中，一项PD1用于NSCLC治疗的III期临床试验结果表明，KRAS突变的肺癌患者使用PD-1抗体的效果要比化疗好(Borghaeietal.，2015)。另外，由著名免疫细胞治疗专家StevenA.Rosenberg团队开展的一项使用肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte，TIL)免疫治疗转移性肠癌患者的II期临床试验结果发现，一位KRAS突变的肠癌患者在接受靶向KRASG12D突变抗原表位的TIL过继免疫治疗之后，肺部的七个转移灶，6个都有缩小(Tranetal.，2016)。该项研究首次证明了过继回输针对患者自体肿瘤突变新抗原的TIL能够对表达该类抗原的肿瘤细胞产生明显的抗肿瘤反应，这将为KRAS突变肿瘤提供一种新的有效治疗手段。但是由于TIL的制备技术难度较大、培养时间较长等问题，无法满足未来临床治疗的需求。即使从TIL中筛选出驱动突变抗原特异性T细胞，克隆并制备TCR-T，也存在较高的技术壁垒，其中包括MHC限制、脱靶和免疫逃逸等问题。树突状细胞(Dendriticcells，DCs)是机体中功能最强的专职抗原递呈细胞(APC)，具有独特的刺激T细胞增殖的能力，是机体免疫应答的始动者，一种天然的“免疫佐剂”(SteinmanandBanchereau，2007)。正是由于DC在诱导特异性抗肿瘤免疫应答中的关键作用，全球范围内一系列关于DC疫苗的研究已持续进行了数十年，相关的临床试验也正在进行或已经完成，并已经在黑色素瘤、前列腺癌、肾癌等肿瘤中展现了较好的疗效(PaluckaandBanchereau，2012)。其中，2010年，用于治疗前列腺癌的DC肿瘤疫苗(Sipuleucel-T)成为第一个FDA批准的治疗性肿瘤疫苗(Kantoffetal.，2010)。DC肿瘤疫苗由于耐受性良好，副作用少，可产生抗肿瘤的免疫应答，已成为细胞免疫治疗中的研究热点，但从总体而言，它们的疗效仍然有限。目前的临床研究普通认为，DC疫苗对进展缓慢的肿瘤显示出一定的疗效，然而对恶性肿瘤，疗效却不明显。CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTcell，CTL)是肿瘤细胞最原始的天敌，具有肿瘤特异性抗原识别和高效杀伤肿瘤细胞的效果，在T细胞免疫应答中起重要作用。因此，对于恶性肿瘤病人特别是中晚期肿瘤病人，由于机体内肿瘤负荷较大而且肿瘤细胞增殖迅速，所以采用DC-CTL技术在体外扩增大量的抗原特异性CTL，然后回输患者体内，会达到更好的治疗效果。同时，相比于其它免疫细胞治疗技术，基于DC体外刺激激活的CTL具有安全、有效和靶向特异性强等优点，将会在肿瘤的免疫治疗中展现广阔的应用前景。目前，DC疫苗在体外负载抗原常用的策略主要包括利用合成肽段、肿瘤溶解物、凋亡的肿瘤细胞和肿瘤RNA致敏及诱导DC产生有效和特异的抗肿瘤反应(Constantinoetal.，2017)。初期的临床试验虽然证实其安全和有效性，但是总的客观反应率很低，并未能显著延长患者的总生存期。同时，这些方法操作复杂、需要大量的患者瘤体组织，由于肿瘤抗原的不确定性注定了这种DC疫苗的临床效果具有不确定性。虽然利用肿瘤特异性或相关抗原多肽致敏DC具有很好的靶向性，但是由于目前可以确定的肿瘤抗原表位很少，同时单一抗原的免疫攻击不仅不足以有效地杀灭肿瘤细胞，反而会诱导肿瘤细胞会产生免疫逃逸。通过携带肿瘤抗原基因的病毒载体感染DC而构建的基因修饰DC疫苗成为近年来DC肿瘤疫苗研究中的热点。其中，相比于逆转录和腺病毒，慢病毒载体既可以转染处于有丝分裂活跃期的细胞，又可以转染分裂缓慢及处于分裂末期的细胞，具有转移基因片段容量较大，目的基因表达时间长、稳定，不易诱发免疫反应等优点，是目前广泛用于实验室研究和临床试验的载体。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的在于提供了一种靶向肿瘤多种KRAS突变抗原表位的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法。为实现上述目的，一种靶向肿瘤多种KRAS突变抗原表位的特异性CTL的制备方法，包括步骤：a)携带7个串联KRAS突变抗原表位序列的慢病毒表达载体的构建；b)步骤a)所述慢病毒载体的病毒包装及浓缩；c)外周血DC细胞的分离与培养；d)步骤b)所制备的慢病毒转染步骤c)所述的DC细胞并诱导分化为成熟DC细胞；e)磁珠法分选外周血来源的CD8+本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向肿瘤多种KRAS突变抗原表位的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，步骤包括：a)携带7个串联KRAS突变抗原表位序列的慢病毒表达载体的构建；b)步骤a)所述慢病毒载体的病毒包装及浓缩；c)外周血DC细胞的分离与培养；d)步骤b)所制备的慢病毒转染步骤c)所述的DC细胞并诱导分化为成熟DC细胞；e)磁珠法分选外周血来源的CD8+T细胞；f)将步骤d)所述的成熟DC细胞与步骤e)所述的CD8+T细胞共培养，获得具有针对7个主要KRAS突变抗原表位的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

【技术特征摘要】
1.一种靶向肿瘤多种KRAS突变抗原表位的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，步骤包括：a)携带7个串联KRAS突变抗原表位序列的慢病毒表达载体的构建；b)步骤a)所述慢病毒载体的病毒包装及浓缩；c)外周血DC细胞的分离与培养；d)步骤b)所制备的慢病毒转染步骤c)所述的DC细胞并诱导分化为成熟DC细胞；e)磁珠法分选外周血来源的CD8+T细胞；f)将步骤d)所述的成熟DC细胞与步骤e)所述的CD8+T细胞共培养，获得具有针对7个主要KRAS突变抗原表位的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。2.如权利要求1所述的靶向肿瘤多种KRAS突变抗原表位的细胞毒性T淋巴细胞(C...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晨蔚，刘平磊，
申请(专利权)人：上海尚泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31