一种基因修饰的树突状细胞疫苗制造技术

本发明专利技术涉及生物技术及医药领域，提供一种经修饰的树突状细胞(dendritic cell，DC)，利用慢病毒载体负载MG‑7Ag抗原模拟表位串联序列感染树突状细胞，使目的抗原序列整合至树突状细胞基因组，本发明专利技术提供一种外周血单核细胞来源树突状细胞体外快速培养方案，本发明专利技术还提供一种活性成分为经该修饰的树突状细胞疫苗。该疫苗用于针对肿瘤的预防和主动免疫治疗。本发明专利技术的MG‑7Ag抗原序列修饰DC疫苗具有经DC‑CTL共培养后可获得高纯度CTL细胞和高效的靶细胞杀伤能力，共培养上清中含有高浓度的IFNγ分泌。肿瘤攻击后，DC‑CTL组小鼠成瘤体积明显小于对照组，这一DC疫苗在MG‑7Ag阳性肿瘤的免疫治疗方面有巨大的潜在价值。

A Genetically Modified Dendritic Cell Vaccine

【技术实现步骤摘要】
一种基因修饰的树突状细胞疫苗专利
本专利技术涉及生物技术及医药领域，具体地，本专利技术涉及一种基因修饰的树突状细胞及包含该修饰树突状细胞的疫苗。专利技术背景树突状细胞(dendriticcells，DC)是人体内功能最强的专职抗原提呈细胞，它能激活CD8+细胞毒性T细胞(CTL)和CD4+辅助性T细胞(Th)，在抗肿瘤、抗病毒等免疫应答过程中发挥重要作用。大多数研究表明体内肿瘤抑制了DC的成熟而非直接抑制DC的功能。研究发现，恶性肿瘤组织内树突状细胞的数量、功能与肿瘤组织原发灶、转移灶中瘤细胞向周围组织浸润的程度以及患者的临床分期呈负相关，而大部分实体肿瘤内浸润树突状细胞的数量越多则患者的预后越好(JSurgOncol，2007，95(2)：123-128)。肿瘤患者体内的树突状细胞存在分化成熟障碍，导致其在表达细胞因子、表面抗原、激活T细胞增殖并诱导CTL生成等方面均存在不同程度的功能缺陷，包括CD8+T细胞增加、CD4+T细胞降低、CD4+/CD8+比例降低以及自然杀伤细胞数量下降等。所以体外诱导功能性DC用于免疫治疗有着重要的临床应用价值。DC广泛分布与人体多个部位，如血液以及肝脾、淋巴结、肺、肾、胃肠道等组织间质，约占外周血单个核细胞总数0.5-1％。DC亚群分类复杂，骨髓源DC(mDC)和淋巴源DC(pDC)是外周血DC的两种主要类型。DC可以经由单核细胞分化生成，分离PBMC中的单核细胞体外培养，GM-CSF和IL4诱导生成未成熟DC(CurrProtocImmunol2005；Chapter22：Unit22F4)。未成熟DC可以通过不同的成熟诱导成分分化成熟，DC的成熟状态是决定DC疫苗有效性的一个关键因素。未成熟DC致敏T细胞能力有限，并且还可能诱导T细胞耐受。另外成熟DC的迁移能力更强，能更有效的迁移至次级淋巴组织的T细胞区，进而诱发免疫反应。体外培养和诱导DC方法的建立，为DC疫苗的研制提供技术平台，在体外培养DC，荷载抗原并诱导细胞成熟，把这种经过修饰的DC回输体内，有多种修饰策略用于DC疫苗的开发和研究中。采用肿瘤细胞或细胞裂解物、凋亡的肿瘤细胞、肿瘤细胞溶解物、肿瘤蛋白、重组表达肿瘤抗原优势表位肽、肿瘤多肽混合物等负载抗原方式致敏DC制成肿瘤疫苗，但受已确认肿瘤抗原限制或因混合抗原包含机体正常抗原诱发自身免疫性疾病。DC回输机体虽可诱导特异性免疫应答，但多数MHC限制性抗原肽的半衰期只有数小时，需要反复多次回输诱导高水平持久免疫应答。将肿瘤抗原编码基因修饰DC制备成疫苗可以延长抗原提呈时间，产生多表位抗原长期有效诱导T细胞免疫应答。以慢病毒载体进行基因转移具有很高的转导效率，介导抗原基因高效持续表达，诱发的免疫应答也更持久，也有利于表达抗原通过内源性抗原途径直接激活CD8+T细胞。MG-7Ag是经MG-7抗体筛选获得的胃癌敏感特异性抗原，它几乎不表达于正常组织，对胃癌有较高的敏感性和特异度，胃癌中阳性率高达82.8％(CANCER，2000，88(2)：280-285)，并在肺癌、结直肠癌和乳腺癌中有较高表达。使用经噬菌体随机肽库筛选获得的MG-7Ag的模拟抗原表位序列，使用多表位串联方式，诱导各表位的特异性免疫反应，解决不同人群的适应性问题。采用GGGS作为间隔序列避免抗原表位之间的相互干扰和模拟表位序列临近氨基酸的对MHC分子的亲和影响。
技术实现思路
本专利技术目的在于针对MG-7Ag抗原的肿瘤特异性和广谱应用价值，提供一种慢病毒载体介导的MG-7Ag模拟表位串联序列修饰树突状细胞，并制备包含该修饰树突状细胞的疫苗，用于针对MG-7Ag阳性表达的肿瘤类型和个体。本专利技术另一目的在于针对现有外周血源树突状细胞体外培养时间较长，提供一种短期可以获得高效DC的体外培养方案。实现上述专利技术目的的技术方案是：合成MG-7Ag四表位串联序列，以GGGS为间隔序列，通过酶切、连接，转接到目的慢病毒载体。慢病毒包装纯化，并进行滴度检测。将分选富集的外周血单核细胞以3-5×106cells/mL细胞密度重悬于KBM551、AIM-V、RPMI-1640任意一培养基，铺布培养瓶中在37℃5％CO2培养箱孵育1h后更换分化诱导培养基。分化诱导48h后慢病毒感染诱导分化DC，分化诱导72h后加入成熟诱导因子诱导成熟。作为优选，分化诱导培养基采用含1-3％自体血浆，300-1000U/mLrhIL-4、300-1000U/mLrhGM-CSF的AIM-V或RPMI-1640培养基加入铺布单核细胞的培养瓶中，然后培养48h，加入感染慢病毒，培养72h后更换新鲜培养基。作为优选，分化诱导培养具体为：1)将12mL的含2％自体血浆，1000U/mLrhIL-4、500U/mLrhGM-CSF的AIM-V或RPMI-1640培养基加入贴壁的单核细胞培养瓶中，置于37℃5％CO2培养箱孵育。2)培养72h后，300g离心8min收集分化的DC，更换新鲜的12mL的含2％自体血浆，1000U/mLrhIL-4、500U/mLrhGM-CSF的AIM-V或RPMI-1640培养基重悬，置于培养瓶，37℃5％CO2培养箱孵育。作为优选，成熟诱导培养基采用含有5μg/mLpoly(I∶C)的分化培养基。将上述携带MG-7Ag模拟表位串联序列的慢病毒感染体外培养的单核诱导树突状细胞即得到本专利技术的DC疫苗，对所得的DC疫苗进行相关免疫学分析以确定其疫苗的效力。所述免疫学效力分析包括DC成熟度检测，即DC表面CD11c、CD80、CD86、CD83分子表达水平检测，体外杀瘤率，细胞表型及细胞因子分泌检测。所述DC疫苗细胞表面CD11c、CD80、CD86、CD83分子均高水平表达，DC-CTL所得CD3+CD8+T细胞纯度＞80％，DC-CTL相比于对照组有显著的杀瘤效果和IFNγ分泌量，因此本专利技术的DC疫苗具有良好的主动免疫治疗效果。附图说明图1所示是本专利技术实施例中MG-7Ag抗原模拟表位串联氨基酸和核苷酸序列。图2所示是本专利技术实施例中第一个MG-7Ag抗原模拟表位氨基酸和核苷酸序列。图3所示是本专利技术实施例中第二个MG-7Ag抗原模拟表位氨基酸和核苷酸序列。图4所示是本专利技术实施例中第三个MG-7Ag抗原模拟表位氨基酸和核苷酸序列。图5所示是本专利技术实施例中第四个MG-7Ag抗原模拟表位氨基酸和核苷酸序列。图6所示是本专利技术实施例中DC表面细胞标志物表达检测情况。图7所示是本专利技术实施例中DC培养上清IL-12p70分泌。图8所示是本专利技术实施例中DC-CTL杀瘤效率情况。图9所示是本专利技术实施例中DC-CTL共培养的细胞表型情况。图10所示是本专利技术实施例中DC-CTL共培养的细胞因子分泌情况。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1一种经修饰的树突状细胞，慢病毒载体负载MG-7Ag抗原模拟表位串联序列感染树突状细胞，使目的抗原序列整合至树突状细胞基因组中。1.MG-7Ag抗原模拟表位串联序列合成携带AscI/XbaI双酶切位点MG-7Ag抗原模拟表位串联序列合成，装载与PUC57质粒。2.MG-7Ag抗原模拟表位串联序列慢病毒表达载体构建慢病毒pLVX-s本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经修饰的树突状细胞，其特征在于，包含利用慢病毒载体感染树突状细胞将MG‑7Ag抗原模拟表位串联序列整合至所述经修饰的树突状细胞中。

【技术特征摘要】
1.一种经修饰的树突状细胞，其特征在于，包含利用慢病毒载体感染树突状细胞将MG-7Ag抗原模拟表位串联序列整合至所述经修饰的树突状细胞中。2.如权利要求1所述经修饰的树突状细胞，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体。3.如权利要求1所述经修饰的树突状细胞，其特征在于，所述MG-7Ag抗原模拟表位串联序列为如图1所示的序列。4.如权利要求3所述MG-7Ag抗原模拟表位串联序列，其特征在于，使用四个筛选的MG-7Ag抗原模拟表位序列经GGGS串联整合，四个抗原模拟表位序列依次为如图2、图3、图4、图5所示的序列。5.一种外周血单核细胞来源树突状细胞体外快速培养，其特征在于，可以在培养第五天收获成熟的树突状细胞：6.如权利要求5所述的单核细胞源树突状细胞快速培...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晨蔚，梁九林，
申请(专利权)人：上海尚泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31