一种双特异性嵌合抗原受体及其应用制造技术

一种双特异性嵌合抗原受体及其应用，该双特异性嵌合抗原受体由CD8α，人源化抗Trop2和抗PD‑L1单链抗体，跨膜区CD8TM，以及胞内区CD28，CD137，和CD3ζ串联构成。本发明专利技术提供的嵌合抗原受体CD8α‑Trop2/PD‑L1 scFv‑CD8TM‑CD28‑CD137‑CD3ζ采用了逆转录病毒技术，可体外感染人T淋巴细胞，所获得的CAR‑T细胞可以通过CAR的单链抗体部分特异性的识别同时表达Trop2和PD‑L1抗原的肿瘤细胞，同时激活CAR‑T细胞，使其释放多种细胞因子，实现对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。

A Bispecific Chimeric Antigen Receptor and Its Application

A bispecific chimeric antigen receptor and its application consist of CD8a, humanized anti-Trop2 and anti-PD_L1 single chain antibodies, transmembrane CD8TM, intracellular CD28, CD137, and CD3 in series. The chimeric antigen receptor CD8alpha Trop2/PD_L1, scFv CD8TM CD28 CD137 CD3 provided by the present invention adopts retroviral technique and can infect human T lymphocytes in vitro. The obtained CAR_T cells can express Trop2 and PD_L1 antigens simultaneously through partial specific recognition of the single chain antibody of CAR, and activate the CAR_T cells to release various cytokines. To achieve specific killing effect on cancer cells.

【技术实现步骤摘要】
一种双特异性嵌合抗原受体及其应用
本专利技术属于细胞免疫技术，具体涉及一种Trop2/PD-L1双特异性嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞免疫治疗（ChimericAntigenReceptorT-cellImmunotherapy,CAR-T）用于肿瘤免疫细胞治疗己经取得很大的进展，特别是在血液系统肿瘤治疗方面取得了令人振奋的疗效。CAR-T细胞是将抗体的高亲和性和T淋巴细胞的杀伤作用相结合，通过构建特异性嵌合抗原受体载体，经基因修饰使T细胞表达这种嵌合抗原受体，即可特异性识别靶抗原从而杀伤肿瘤细胞。CAR的结构包括能够识别肿瘤抗原的单链抗体序列（scFv）和胞内免疫受体酪氨酸活化基序（ITMA，通常为CD3ζ）以及共刺激分子信号（CM，通常为CD28、CD134、CD137等），这样制备的CAR-T细胞一方面可以通过scFv靶向肿瘤细胞，另一方面通过胞内分子激活T细胞对肿瘤细胞的杀伤力。T细胞作为肿瘤免疫细胞治疗的效应细胞，主要原因有T细胞反应具有特异性，分泌各种细胞因子，杀伤肿瘤细胞；CAR-T细胞在体内可增殖，一旦被活化可进行1000倍的克隆扩增；CAR-T细胞可到达抗原所在位点并清除癌灶；CAR-T细胞反应具有记忆性，可较长时间维持治疗效果等。目前临床上采用的CAR-T细胞为各种T细胞的混合细胞群，包括CD4+，CD8+，记忆T细胞，效应T细胞等，不同的T细胞亚群可能在T细胞过继治疗过程中起着协同作用。虽然CD19-CAR-T细胞治疗急性白血病已取得重大突破，但对实体瘤的治疗仍存在很多问题，从而导致疗效不佳。CAR-T嵌合的理想目标抗原是仅在肿瘤细胞高表达，而在正常组织中不表达。CAR-T细胞利用靶向抗原的单链抗体分子能特异性识别肿瘤细胞，进而通过免疫共刺激信号分子刺激，特异性地杀伤肿瘤细胞，并避免杀伤正常组织，减少毒副作用。一个单链抗体的CAR-T细胞仍然存在on-target/offtumortoxicity的风险，双特异性单链抗体则可大大降低这种风险。另外，抗原特异性T细胞在患者体内会受到负性调节因子的调控，使其抗肿瘤效应丧失或被削弱。经研究发现，体内的这种免疫抑制性环境主要来自肿瘤微环境，大量免疫抑制性分子和细胞可部分或完全抑制肿瘤特异性T细胞的增殖活化，发挥抗肿瘤效应，进而使抗原特异性T细胞回输治疗的效果被显著削弱，如目前研究较多的是程序性死亡受体-1（programmeddeath-1，PD-1）及其配体PD-L1（programmeddeathligand1，PD-L1）。PD-1为负性协同刺激分子受体，其胞浆区含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和一个免疫受体酪氨酸转换基序（ITSM）。PD-1主要在活化的T、B和NK细胞上诱导表达。PD-1有PD-L1和PD-L2两个配体，PD-L1广泛表达于多种类型肿瘤细胞上，而PD-L2仅表达于活化的巨噬细胞、树突状细胞、骨髓来源的基质细胞和个别肿瘤细胞株。研究表明，PD-1随T细胞活化程度而逐渐上调，PD-1和PD-L1相互结合后引发抑制信号的产生，在肿瘤微环境中发挥着关键作用，不但能阻断T细胞活化第一、二信号，阻止效应性T细胞活化增殖，发挥抗肿瘤效应，而且还能辅助调节性T细胞（regμLatorycell,Treg）发挥抑制性功能，甚至诱导辅助性T细胞（Thelpercells，Th）向Treg转化。PD-1/PD-L1在多种实体瘤中广泛存在，可能是CAR-T技术在实体瘤中效果不佳的主要原因之一。PD-1/PD-L1单克隆抗体在治疗实体瘤的临床试验中已经取得非常显著的疗效。有报道称，PD-L1在胃癌组织及胃癌转移淋巴组织中显著高表达，并与患者的生存预后相关。人滋养层细胞表面抗原2（humantrophoblastcellsurfaceantigen2，TACSTD2/Trop2/M1S1/GA733-1)是一个膜表面抗原，位于染色体1q32。Trop2最早发现在人滋养层细胞表面，分子量约为36kDa，是单跨膜蛋白，分为膜外区、跨膜区、膜内区和一个磷酸化的胞质尾。Trop2被TNF-α转化酶裂解为胞外域和胞内域，胞内域离开跨膜区后可以进入胞浆或者核内发挥作用。Trop2常过表达于不同的上皮组织肿瘤，特别是胃腺癌细胞膜表面，对肿瘤的恶性生物学行为有促进作用。可以作为许多恶性肿瘤靶向治疗的靶点。
技术实现思路
解决的技术问题：基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种双特异性嵌合抗原受体及其应用。技术方案：一种双特异性嵌合抗原受体，该双特异性嵌合抗原受体由CD8α，人源化抗Trop2和抗PD-L1单链抗体，跨膜区CD8TM，以及胞内区CD28，CD137，和CD3ζ串联构成。编码上述双特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。含有编码双特异性嵌合抗原受体的核酸序列如SEQIDNO.2所示。编码上述人抗Trop2单链抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，轻链氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。编码上述人抗Trop2单链抗体的重链核酸序列如SEQIDNO.5所示，轻链核酸序列如SEQIDNO.6所示。编码上述人抗PD-L1单链抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，轻链氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。编码上述人抗PD-L1单链抗体的重链核酸序列如SEQIDNO.9所示，轻链核酸序列如SEQIDNO.10所示。上述CD8α，跨膜区CD8TM，以及胞内区CD28，CD137，和CD3ζ的胞内区串联构成的结果为信号转导结构域，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、SEQIDNO.17、SEQIDNO.19所示。编码上述信号转导结构域的核酸序列分别如SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16、SEQIDNO.18、SEQIDNO.20所示。上述双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。上述双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。一种抗胃癌药物，有效成分为上述双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。有益效果：本专利技术根据本实验室从全人源抗体库筛选出的抗Trop2抗体Fab和抗PD-L1抗体的Fab，经过密码子优化，在5’段加上信号肽，全基因合成嵌合抗原受体CD8α-Trop2/PD-L1scFv-CD8TM-CD28-CD137-CD3ζ，并将该合成的序列克隆到逆转录病毒载体中，构建出抗人Trop2/PD-L1CAR表达质粒，即获得本专利技术的嵌合抗原受体CD8α-Trop2/PD-L1scFv-CD8TM-CD28-CD137-CD3ζ。利用该嵌合抗原受体与逆转录病毒的包装质粒RD114env在293T细胞中对病毒进行包装，利用此逆转录病毒感染T淋巴细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。将获得的CAR-T细胞在体外与肿瘤细胞共培养，通过流式细胞术检测CAR-T细胞表面抗原表达情况，CCK-8法检测该CAR-T细胞对Trop2/PD-L1不同表达水平的胃癌细胞的特异性杀伤作用，以证实该双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞对胃癌细胞的特异性杀伤作用，且效应细胞（E）和靶细胞（T）在20:1时，双特异性Trop本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双特异性嵌合抗原受体，其特征在于该双特异性嵌合抗原受体由CD8α，人源化抗Trop2和抗PD‑L1单链抗体，跨膜区CD8TM，以及胞内区CD28，CD137，和CD3ζ串联构成。

【技术特征摘要】
1.一种双特异性嵌合抗原受体，其特征在于该双特异性嵌合抗原受体由CD8α，人源化抗Trop2和抗PD-L1单链抗体，跨膜区CD8TM，以及胞内区CD28，CD137，和CD3ζ串联构成。2.根据权利要求1所述双特异性嵌合抗原受体，其特征在于编码所述双特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述双特异性嵌合抗原受体，其特征在于含有编码双特异性嵌合抗原受体的核酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求1所述双特异性嵌合抗原受体，其特征在于编码所述人抗Trop2单链抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，轻链氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；编码所述人抗PD-L1单链抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，轻链氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。5.根据权利要求4所述双特异性嵌合抗原受体，其特征在于编码所述人抗Trop2单链抗体的重链核酸序列如SEQIDNO.5所示，轻链核酸序列如SEQIDNO.6所...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵薇，冯振卿，朱进，唐奇，贾立周，章明炯，黄骁辰，
申请(专利权)人：南京市第一医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32