一种比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶及分子改造方法和表达工程菌技术

本发明专利技术涉及一种比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶PhHepI

A Directional Modification Enzyme and Molecular Modification Method for Heparinase I Enhanced by Specific Enzyme Activity and Its Expression in Engineering Bacteria

The present invention relates to a directional modification enzyme PhHepI of heparinase I with higher activity than that of enzymes.

【技术实现步骤摘要】
一种比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶及分子改造方法和表达工程菌
本专利技术属于基因工程和蛋白质表达
，涉及PhHepIA259D和PhHepIS169D/A259D酶基因的构建和表达，以及该酶的性质和制备研究，尤其是一种比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶及分子改造方法和表达工程菌。
技术介绍
肝素(Heparin)在自然界中广泛存在，是动物体内一种天然抗凝血物质。最开始它是在肝脏中被发现，所以被命名为肝素。它广泛分布在哺乳动物组织中，比如肝、肺、肠粘膜、心、胎盘和肌肉等，以共价键形式和蛋白结合。目前商业化的肝素主要从牛肺和猪肠粘膜中提取得到。低分子肝素(Lowmolecularweightheparin，LMWH)是由肝素经过一定的化学物理方法裂解后产生的小肝素片段，低分子量肝素与蛋白或细胞的结合作用力下降，但是在抗凝血活性方面会增强。同普通肝素相比，LMWH能降低抗因子Ⅱa的活性。LMWH具有发生出血率低，体内生物利用度高等优点。它是近些年来临床应用发展极快的抗凝血和抗血栓类药物。低分子肝素的制备可以分为物理方法，化学方法，生物法以及合成法。化学解聚法技术比较成熟且应用广泛，但是存在一些缺陷，如生产过程溶液对环境造成污染，且反应过程中需要的强氧化剂和激烈的反应条件可能会导致LMWH的药理活性降低。生物解聚法与化学解聚法相比具有反应条件温和、选择性强、对环境污染小等特点，所以生物解聚法越来越受到人们关注。目前肝素类药物的市场需求日益增多，2016年肝素原料药的需求达到44.30万亿单位，全球肝素类药物市场已达到125.8亿美元，市场巨大，并且持续增加。肝素类药物的发展方向趋向于低分子肝素和超低分子肝素，目前对于低分子肝素的制备，大都采用化学裂解法，但是此方法存在组分单一性差，分离成本高；三废污染，纯度差等缺点，越来越不适合绿色环保的理念。而酶解法条件温和，对肝素本身的结构特征不造成影响，且没有副反应发生，得率较高；反应一步完成，比较容易实现生产；反应没有产生不纯物，比较利于下游的分离纯化，其中以肝素酶I的酶解应用最为广泛。目前市场上肝素酶I的价格极其昂贵，并且其本身的酶活性较差，很难适应工业化生产的要求。肝素酶I(heparanase)是一类能够裂解肝素类结构物质的多糖裂解酶，主要用于制备低分子肝素以及肝素类物质分子的机构测定。肝素酶I分子量大小约为42KD，它既存在于原核生物，也存在于真核生物中。原核生物来源的肝素酶I主要来自于肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)，还包括一些拟杆菌和芽孢杆菌等，它在制备低分子量肝素、清除体外血液循环中肝素和确定肝素精细结构方面有着重要作用。目前对于肝素酶I的研究大都来自于肝素黄杆菌，但基于理性设计的肝素酶I的分子改造，尤其是关于肝素酶I比酶活的分子改造研究未见有报道。通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，克服当前肝素酶I产量低、活性低的缺点，提供一种比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶及分子改造方法和表达工程菌，与野生型相比，本专利技术定向改造酶具有更高的比酶活，有较大应用潜力，也为HepI的研究奠定了理论基础。本专利技术解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：一种比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶PhHepIA259D，其核苷酸序列为SEQIDNO：1。如上所述的比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶PhHepIA259D编码的高活性肝素酶I，其完整的氨基酸序列为SEQIDNO：2。一种比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶PhHepIS169D/A259D，其核苷酸序列为SEQIDNO：3。如上所述的比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶PhHepIS169D/A259D编码的高活性肝素酶I，其完整的氨基酸序列为SEQIDNO：4。一种高活性肝素酶I的分子改造方法，步骤如下：通过以多形拟杆菌来源的肝素酶IBtHepI为模板，利用同源建模和序列同源性比对肝素黄杆菌来源的肝素酶IPhHepI进行分析，对其进行定向改造，得到比酶活显著提高的高活性肝素酶IPhHepIA259D和/或PhHepIS169D/A259D。而且，具体步骤如下：⑴PhHepI的空间结构的模拟：登录蛋白质结构数据库，经过BLAST比对，找到与PhHepI具有高度同源性的序列：选择已经具有晶体结构的BtHepI为模板，两者的序列同源性为62.5％，运用SWISS-MODEL服务器在线对PhHepI进行模拟空间结构；运用在线网站对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性更高的模拟结构；⑵比酶活提高的PhHepI突变体的理性设计：已知BtHepI序列中155位-ASP、253位-ASP的氨基酸为重要氨基酸，分别处于钙离子结合区域以及底物结合区域；通过将PhHepI和BTHepI的结构和序列进行比对分析以及预测，在PhHepI结构序列中对应的氨基酸残基位点是169位-SER和259位-ALA，综合以上因素选择将PhHepI序列中的169位丝氨酸突变为天冬氨酸、259位丙氨酸突变为天冬氨酸以及两个位点的复合突变。而且，所述蛋白结构数据库网址为：htpp：//rcsb.org；所述具有晶体结构的BtHepI，其ProteinDataBank登录号为3ikw；所述在线网站为：http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/。一种含突变基因PhhepiA259D和/或PhhepiS169D/A259D表达工程菌，其构建方法，步骤如下：基于突变位点，设计并合成定点突变的引物如下：S169D-F：SEQIDNO：5：5′-CAGTGGCACGGTGCTCCGGATCGTACTCTTGTTGCTACT-3′S169D-R：SEQIDNO：6：5′-AGTAGCAACAAGAGTACGATCCGGAGCACCGTGCCACTG-3′A259D-F：SEQIDNO：7：5′-GTGGCTTACTGATAAAGATGATCGTAACAACGCTA-3′A259D-R：SEQIDNO：8：5′-TAGCGTTGTTACGATCATCTTTATCAGTAAGCCCA-3′以含有Phhepi基因的质粒pE-SUMO-Phhepi为模板，使用以上引物进行PCR，反应条件为：95℃2min；95℃30s，60℃30s，72℃7min，30个循环；72℃5min；对其PCR产物进行DnPI酶消化，进行核酸电泳以及切胶回收，将其转化入DH5α感受态，通过抗生素筛选提取阳性克隆子的质粒并送去测序；将测序正确的表达质粒pE-SUMO-PhhepiA169D、pE-SUMO-PhhepiA259D、pE-SUMO-PhhepiS169D/A259D转化入表达菌株RosettaDE3中，即可成功构建PhHepI突变体的表达工程菌。一种如上所述的含突变基因PhhepiA259D和/或PhhepiS169D/A259D表达工程菌的高效表达方法，步骤如下：将含突变基因PhhepiA259D和/或PhhepiS169D/A259D表达工程菌分别接种于含卡那霉素和氯霉素抗性的LB培养基，37℃，220r/min培养过夜；其中，所述LB培养基的配方为：NaC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶PhHepIA259D，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶PhHepIA259D，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO：1。2.如权利要求1所述的比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶PhHepIA259D编码的高活性肝素酶I，其特征在于：其完整的氨基酸序列为SEQIDNO：2。3.一种比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶PhHepIS169D/A259D，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO：3。4.如权利要求3所述的比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶PhHepIS169D/A259D编码的高活性肝素酶I，其特征在于：其完整的氨基酸序列为SEQIDNO：4。5.一种高活性肝素酶I的分子改造方法，其特征在于：步骤如下：通过以多形拟杆菌来源的肝素酶IBtHepI为模板，利用同源建模和序列同源性比对肝素黄杆菌来源的肝素酶IPhHepI进行分析，对其进行定向改造，得到比酶活显著提高的高活性肝素酶IPhHepIA259D和/或PhHepIS169D/A259D。6.根据权利要求5所述的高活性肝素酶I的分子改造方法，其特征在于：具体步骤如下：⑴PhHepI的空间结构的模拟：登录蛋白质结构数据库，经过BLAST比对，找到与PhHepI具有高度同源性的序列：选择已经具有晶体结构的BtHepI为模板，两者的序列同源性为62.5％，运用SWISS-MODEL服务器在线对PhHepI进行模拟空间结构；运用在线网站对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性更高的模拟结构；⑵比酶活提高的PhHepI突变体的理性设计：已知BtHepI序列中155位-ASP、253位-ASP的氨基酸为重要氨基酸，分别处于钙离子结合区域以及底物结合区域；通过将PhHepI和BTHepI的结构和序列进行比对分析以及预测，在PhHepI结构序列中对应的氨基酸残基位点是169位-SER和259位-ALA，综合以上因素选择将PhHepI序列中的169位丝氨酸突变为天冬氨酸、259位丙氨酸突变为天冬氨酸以及两个位点的复合突变。7.根据权利要求6所述的高活性肝素酶I的分子改造方法，其特征在于：所述蛋白结构数据库网址为：htpp：//rcsb.org；所述具有晶体结构的BtHepI，其ProteinDataBank登录号为3ikw；所述在线网站为：http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/。8.一种含突变基因PhhepiA259D和/或PhhepiS169D/A259D表达工程菌，其特征在于：其构建方法，步骤如下：基于突变位点，设计并合成定点突变的引物如下：S169D-F：SEQIDNO：5S169D-R：SEQIDNO：6A259D-F：SEQIDNO：7A259D-R：SEQIDNO：8以含有Phhepi基因的质粒pE-SUMO-Phhepi为模板，...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗学刚，张川，杨宝成，张同存，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12