本发明专利技术涉及alpha‑葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。本发明专利技术首次揭示了石蒜属植物忽地笑的alpha‑葡萄糖苷酶，其具有良好的转葡萄糖基活性，可以产生alpha‑葡萄糖苷物质。本发明专利技术还揭示了编码所述alpha‑葡萄糖苷酶的多核苷酸，表达所述alpha‑葡萄糖苷酶的载体与宿主细胞，以及生产α‑熊果苷的方法。
【技术实现步骤摘要】
一种alpha-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用
本专利技术涉及生物技术和植物生物学领域；更具体地，本专利技术涉及一种来源于石蒜科植物的alpha-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用。
技术介绍
alpha-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase,α-glucosidase,EC3.2.1.20)在植物体中具有重要的生理作用。淀粉的水解是植物种子萌发过程中最重要的事件之一，产生为胚芽生长提供能量的碳源物质—D-葡萄糖。在植物种子萌发过程中，alpha-葡萄糖苷酶作用于α-淀粉酶、β-淀粉酶和脱支酶水解淀粉产生的麦芽糖及麦芽寡糖，生成游离的D-葡萄糖。目前，研究者已对多种植物的alpha-葡萄糖苷酶编码基因进行了克隆和表达分析，发现不同来源的alpha-葡萄糖苷酶的底物特异性差异很大。荞麦和甜菜来源的alpha-葡萄糖苷酶具有长链麦芽寡糖的底物特异性，例如，二者对麦芽七糖的Kcat/Km值分别是其对麦芽糖的8倍和50倍；而大麦alpha-葡萄糖苷酶更倾向于催化短链底物。alpha-葡萄糖苷酶不仅能够催化水解末端非还原性的α-1,4连接的葡萄糖苷键释放D-葡萄糖，还能够将从低聚糖类底物非还原末端释放的D-葡萄糖残基转移到另一糖类或苯酚类或蛋白质类底物的羟基形成α-1,6葡萄糖苷键，产生非发酵性的低聚异麦芽糖或糖苷、糖酯、糖肽等，在低聚异麦芽糖及一些非天然的alpha-葡萄糖苷等生产领域具有重要的应用。忽地笑(Lycorisaurea)是多年生草本球根药用植物，属于石蒜科石蒜属，富含加兰他敏、石蒜碱、文殊兰碱等石蒜科植物所特有的生物碱(石蒜科生物碱)与其它生物碱、以及其它类型的植物天然产物(如alpha-葡萄糖苷等)。这些天然产物具有重要的生物活性和应用价值。例如，加兰他敏作为一种特定的、竞争性的、可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂，在临床上用于治疗阿尔茨海默病(老年痴呆症)。又例如，作为一种苯酚衍生物，α-熊果苷(对-羟基苯-alpha-D-吡喃葡萄糖苷)通过其糖苷键的水解缓慢释放活性组分氢醌(对-羟基苯酚，对苯二酚)，能够抑制参与黑色素合成的关键酶酪氨酸酶的活性。相较于氢醌，α-熊果苷是一种安全、温和的用于治疗色素沉着过度失调症的试剂。此外，α-熊果苷还能保护肌肤免受自由基的侵害，亲水性佳，在化妆品工业具有巨大的市场潜力。这些天然产物具有广泛的应用和需求。在这些天然产物的生物合成过程中，alpha-葡萄糖苷酶其中。但是，石蒜属植物alpha-葡萄糖苷酶及其编码基因尚未被分离与克隆。因此，本领域有必要开发石蒜属植物忽地笑的alpha-葡萄糖苷酶。该蛋白及其编码基因可通过植物转基因和异源表达的方式进行天然产物的生物转化与生物合成。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种石蒜科植物的alpha-葡萄糖苷酶，所述的alpha-葡萄糖苷酶选自：(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白质；或(b)将SEQIDNO:1氨基酸序列经过一个或多个(如1─51个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有alpha-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质；或(c)与SEQIDNO:1氨基酸序列有至少82％序列相同性，且具有alpha-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本专利技术SEQIDNO:1所示的蛋白质是从忽地笑(Lycorisaurea)中分离得到的一种新的alpha-葡萄糖苷酶。为便于表述，将SEQIDNO:1所示的蛋白质命名为alpha-葡萄糖苷酶LaAgl2。在一个优选例中，所述的alpha-葡萄糖苷酶活性是指利用麦芽糖为底物，产生D-葡萄糖。在另一个优选例中，所述的alpha-葡萄糖苷酶活性是指以麦芽糖为糖基供体，催化转糖基反应合成alpha-葡萄糖苷产物。在另一个优选例中，所述的序列(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。本专利技术的另一目的在于提供分离的多核苷酸，该多核苷酸是编码所述alpha-葡萄糖苷酶的多核苷酸。在一个优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性，本领域技术人员可以根据需要使用合适特定物种表达的密码子。因而，本专利技术alpha-葡萄糖苷酶的多核苷酸还包括由SEQIDNO:2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到的编码具有alpha-葡萄糖苷酶活性的核苷酸序列。本专利技术的又一目的是提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。所述的载体是将本专利技术的编码所述alpha-葡萄糖苷酶的多核苷酸与表达载体可操作地连接，得到能够表达本专利技术所述alpha-葡萄糖苷酶的重组表达载体或抑制本专利技术所述alpha-葡萄糖苷酶编码多核苷酸表达的基因沉默载体。在一个优选例中，该载体是含有编码所述alpha-葡萄糖苷酶的SEQIDNO:2所示序列的重组表达载体pET28a-LaAgl2。在另一个优选例中，该载体是含有编码所述alpha-葡萄糖苷酶的SEQIDNO:2所示序列中第154-2961位多核苷酸的重组表达载体pET28a-LaAgl2(ΔN51)。本专利技术的又一目的是提供一种表达构建物。所述表达构建物包括以下酶的编码基因和/或基因表达盒：所述的alpha-葡萄糖苷酶；和/或糖基受体生物合成酶。所述基因表达盒是酶在宿主细胞中表达与调控所需要的生物学元件，包括启动子、增强子、衰减子、核糖体结合位点、Kozak序列、内含子和/或转录终止子等；此外，还可包括标签编码序列和/或信号(肽)编码序列等。在一个优选例中，所述的表达构建物还包括大肠杆菌启动子、大肠杆菌核糖体结合位点和/或大肠杆菌转录终止子。本专利技术的又一目的是提供一种宿主细胞，它含有所述的载体或表达构建物或基因组中整合有所述的多核苷酸。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、运动假单胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。所述的真菌细胞包括酵母细胞。将所述的重组表达载体或者基因沉默载体或者表达构建物导入所述的适当宿主细胞中，获得表达本专利技术所述alpha-葡萄糖苷酶的基因工程菌株、转基因细胞系、转基因愈伤、转基因组织、转基因植株或者基因工程植株。更佳地，所述的宿主细胞是内源存在糖基受体物质或其前体的细胞。本专利技术的又一目的是提供所述的alpha-葡萄糖苷酶的用途，用于转葡萄糖基给糖基受体，产生alpha-葡萄糖苷产物。在一个优选例中，所述的糖基受体是对苯二酚；或所述的产物是α-熊果苷。本专利技术的又一目的是提供所述的表达构建物的用途，用于生产α-熊果苷。本专利技术的又一目的是提供一种生产α-熊果苷的方法。所述方法包括：利用所述的alpha-葡萄糖苷酶，以麦芽糖为糖基供体，以对苯二酚为糖基受体，合成α-熊果苷。在一个优选例中，所述方法包括：以所述的表达构建物转化宿主细胞，利用转化的宿主细胞催化对苯二酚和麦芽糖合成α-熊果苷；所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、运动假单胞菌和乳酸菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。所述的真菌细胞包括酵母细胞。本专利技术首次揭示了石蒜科植物忽地笑来源的alpha-葡萄糖苷酶La本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种alpha‑葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的alpha‑葡萄糖苷酶选自：(a) 氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质；或(b) 将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的，与SEQ ID NO:1氨基酸序列有至少82%序列相同性，且具有alpha‑葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种alpha-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的alpha-葡萄糖苷酶选自：(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白质；或(b)将SEQIDNO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的，与SEQIDNO:1氨基酸序列有至少82%序列相同性，且具有alpha-葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述的alpha-葡萄糖苷酶的多核苷酸；所述的多核苷酸包括分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。4.权利要求3所述的载体的用途，其特征在于：(a)表达权利要求1所述的alpha-葡萄糖苷酶；或(b)抑制权利要求1所述的alpha-葡萄糖苷酶的表达；或(c)抑制权利要求2所述的多核苷酸的表达。5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。6.权利要求1所述的alpha-葡萄糖苷酶的用途，其特征在于，转葡萄糖基给糖基受体产生alpha-葡萄糖苷。7.一种表达构建物，其特征在于，所述表达构建物包括以下...
【专利技术属性】
技术研发人员：李宜奎，汪仁，李洁，李晓丹，徐晟，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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