半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)定点偶联位点筛选制造技术

本发明专利技术公开了一种半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物，其特征在于：抗体为半胱氨酸定点插入抗体，半胱氨酸插入位点包含选自以下位点的一个或多个：kappa/λ轻链恒定区轻链第110位、第111位、第142位，IgG抗体重链恒定区重链第254位、第255位、第258位、第259位、第354位、第355位、第357位、第378位、第379位、第386位、第387位或第410位。

Screening of site directed coupling sites for cysteine modified antibody toxin conjugates (TDC)

The present invention discloses a cysteine modified antibody toxin conjugate, which is characterized by: the antibody is a cysteine fixed-point insertion antibody, and the cysteine insertion site contains one or more sites selected from the following sites: light chain 110, 111, 142 in the constant region of kappa/lambda light chain, and heavy chain in the constant region of IgG antibody heavy chain. 254, 255, 258, 259, 354, 355, 357, 378, 379, 386, 387 or 410.

【技术实现步骤摘要】
半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)定点偶联位点筛选
本专利技术涉及一种化合物及其制备方法和用途，特别涉及一类半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)及其制备方法和用途。技术背景：抗体-毒素偶联物(Antibodydrugconjugate,ADC)是靶向治疗的热点领域，已在美国获批上市的两个药物Adcetris和Kadcyla表现出良好的临床疗效，并且有超过50个ADC药物在进行临床阶段研究。此专利披露的全新半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)相较非定点偶联的ADC具有药物均一性好，副作用小等优点，临床前研究结果显示其显著优于非定点偶联ADC。
技术实现思路
：本专利技术的化合物半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)，半胱氨酸插入位点包含选自以下15个插入位点的一个或多个位点：轻链第110位(Kabat编号，其氨基酸序列EIKRTCVAAPS)、轻链第111位(Kabat编号，其氨基酸序列IKRTVCAAPSV)、轻链第142位(Kabat编号，其氨基酸序列NNFYPCREAKV)，重链第254位(其氨基酸序列为ISRTPCEVTCV)、重链第255位(其氨基酸序列为SRTPECVTCVV)、重链第258位(其氨基酸序列为PEVTCCVVVDV)、重链第259位(其氨基酸序列为EVTCVCVVDVS)、重链第354位(其氨基酸序列为PSRDECLTKNQ)、重链第355位(其氨基酸序列为SRDELCTKNQV)、重链第357位(其氨基酸序列为DELTKCNQVSL)、重链第378位(其氨基酸序列为IAVEWCESNGQ)、重链第379位(其氨基酸序列为AVEWECSNGQP)、重链第386位(其氨基酸序列为GQPENCNYKTT)、重链第387位(其氨基酸序列为QPENNCYKTTP)、重链第410位(其氨基酸序列为KLTVDCKSRWQ)。包含一个或多个上述半胱氨酸插入突变的抗体保持了其亲本抗体与抗原结合的能力(亲和力)。通过其轻链插入的半胱氨酸巯基或/和重链插入的半胱氨酸巯基与payload进行抗体-毒素偶联物(TDC)定点偶联，毒素比抗体比例DAR为1.6-2.0或3.2-4.0。实施例实施例1mc的合成于30ml冰醋酸中加入6-氨基己酸3.9g(0.03mol)和1.2eq的马来酸酐3.5g(0.036mol)。反应液于120℃搅拌反应4～6h。反应完毕后，停止加热，自然冷却到室温。60℃减压浓缩除去大部分醋酸。所得棕黄色粘稠液倒入水中，再加入乙酸乙酯20ml×3萃取，合并有机层。有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到棕黄色油状物，加入50ml水搅拌，有类白色固体析出，过滤，50℃减压干燥的目标产品5.08g，收率80％。mp：89-92℃。m/z：212.2[M+H]+。1HNMR(400Mz,DMSO)：13.21(br,1H,COOH)、6.75(s,2H,COCH＝CHCO)、3.63(t,2H,J＝7.2Hz,NCH2CH2)、2.42(t,2H,J＝7.4Hz,CH2COOH)、1.52-1.68(m,4H,NCH2CH2CH2CH2)、1.30-1.42(m,2H,NCH2CH2CH2CH2)。实施例2Mc-OSu的合成在氮气保护下于50ml乙腈中加入4.7g(22mmol)MC和25g(22mmol)HOSu。另取4.5g(22mmol)DCC溶于25ml乙腈中，保持内温在0℃左右，将其缓慢滴入反应液中。反应液于0℃反应2小时后再室温反应过夜。过滤，滤饼用乙腈10ml×3洗涤，滤液减压浓缩至干。所得油状物于室温减压干燥6h得到浅棕色固体6.4g，收率95％。(不纯化直接投下一步反应)m/z：309.2[M+H]+。1HNMR(400Mz,CDCl3)：1～2(m,6H,CCH2CH2CH2C)、2.68(t,2H,CH2CO)，2.95(s,4H,COCH2CH2CO)、3.68(t,2H,CH2N)、6.81(s,2H,CH＝CH)。实施例3Fmoc-Val-OSu的合成于100mlTHF中加入Fmoc-Val10g和HOSu3.4g。另取DCC6g溶于50ml乙腈中，保持内温在0℃左右，将其缓慢滴入反应液中。反应液于室温搅拌反应24小时。过滤，滤饼用THF洗涤，滤液减压浓缩得到透明油状物。油状物未经纯化直接投下一步反应。m/z：437.4[M+H]+实施例4.Fmoc-vc的合成于20mlTHF中加入Cit4.0g(1.05eq)和碳酸氢钠的水溶液60ml(NaHCO32g,1.05eq)。另取22.35mmolFmoc-Val-OSu溶于60mlDME中，再将其加入反应液中。反应液于室温下搅拌反应24小时。反应完毕后，向体系中加入15％柠檬酸水溶液110ml，然后再用EA萃取两次，合并有机层，减压浓缩得到白色固体。并向白色固体中加入甲基叔丁基醚100ml搅洗，过滤，滤饼于40℃减压干燥4h得产品4.83g，收率65％。m/z：497.6(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.92(6H,m)、1.35～1.65(4H,m)、2.10(1H,m)、3.01(2H,q)、3.99(1H,t)、4.01-4.45(2H,m)、4.45(2H,t)、5.46(2H,br)、6.03(1H,t)、7.20-8.02(8H,m)、8.25(1H,d)。实施例5.Fmoc-vc-PABOH的合成于反应瓶中加入DCM/MeOH＝2/1混合溶剂60ml，再加入Fmoc-vc2g(4.2mmol)和PABOH1.04g(2eq)，搅拌溶解部分后再加入EEDQ2.0g(2eq)。反应体系在室温条件下避光搅拌反应2.0d。反应完毕后，40℃减压浓缩得到白色固体。收集白色固体，加入甲基叔丁基醚100ml搅洗，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤，所得白色固体40℃减压干燥得到2.2g，收率约88％。m/z：602.6(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.95(6H,m)、1.45～1.69(4H,m)、2.10(1H,m)、3.11(2H,m)、3.99(1H,m)、4.30(2H,d)、4.05～-4.66(2H,m)、4.55(2H,d)、5.21(1H,t)、5.51(2H,br)、6.11(1H,t)、7.09-8.10(12H,m)、8.21(1H,d)、10.51(1H,br)。实施例6.vc-PABOH的合成于10mlNMP中加入Fmoc-vc-PABOH490mg(0.815mmol)搅拌溶解，再加入二乙胺2ml。于室温下搅拌反应24h。反应完毕后，于40℃减压浓缩，所得油状物中加入20mlDCM搅拌析晶，过滤，滤饼用DCM洗涤，所得固体减压干燥得到277mg,收率90％。m/z：380.2(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.89(6H,m),1.31～1.61(4H,m),1.82(1H,m),2.86(1H,m),2.89(2H,d),4.38(2H,d),4.44(1H,m),5.01(1H,br),5.35(2H,br),5.84(1H,br),7.14(2H,d),7.42(2H,d本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物，其特征在于：抗体为半胱氨酸定点插入抗体，半胱氨酸插入位点包含选自以下位点的一个或多个：kappa/λ轻链恒定区轻链第110位、第111位、第142位，IgG抗体重链恒定区重链第254位、第255位、第258位、第259位、第354位、第355位、第357位、第378位、第379位、第386位、第387位或第410位。

【技术特征摘要】
2017.06.20 CN 20171046976151.一种半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其特征在于：抗体为半胱氨酸定点插入抗体，半胱氨酸插入位点包含选自以下位点的一个或多个：kappa/λ轻链恒定区轻链第110位、第111位、第142位，IgG抗体重链恒定区重链第254位、第255位、第258位、第259位、第354位、第355位、第357位、第378位、第379位、第386位、第387位或第410位。2.根据权利要求1所述的一种半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其特征在于：所述半胱氨酸插入位点的氨基酸序列包含以下序列的一个或多个：LC-110ins：EIKRTCVAAPS；LC-111ins：IKRTVCAAPSV；LC-142ins：NNFYPCREAKV；HC-254ins：ISRTPCEVTCV；HC-255ins：SRTPECVTCVV；HC-258ins：PEVTCCVVVDV；HC-259ins：EVTCVCVVDVS；HC-354ins：PSRDECLTKNQ；HC-355ins：SRDELCTKNQV；HC-357ins：DELTKCNQVSL；HC-378ins：IAVEWCESNGQ；HC-379ins：AVEWECSNGQP；HC-386ins：GQPENCNYKTT；HC-387ins：QPENNCYKTTP；HC-410ins：KLTVDCKSRWQ。3.根据权利要求1所述的一种半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其特征在于：所述插入的半胱氨酸游离巯基(-SH)通过连接子与高活性细胞毒素进行定点偶联；连接子与插入的半胱氨酸偶联的抗体轻链氨基酸序列为：EIKRTCVAAPS、IKRTVCAAPSV和NNFYPCREAKV；连...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱义，王一茜，卓识，李杰，余永国，万维李，
申请(专利权)人：四川百利药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川,51