神经细胞细胞外囊泡制造技术

本发明专利技术公开了神经细胞外囊泡(EV)和使用这些EV治疗脊髓损伤、中风、外伤性脑损伤和神经退行性疾病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】神经细胞细胞外囊泡相关申请的交叉引用本申请要求2015年11月18日提交的美国临时申请No.62/256,823的权益，将其以其整体在此引入作为参考。
技术介绍
神经系统的疾病和损伤，包括先天性疾病、癌症、退行性疾病和脊髓损伤，影响了数百万所有年龄段的人。当在发育过程中不能正确形成大脑或脊髓时，就会出现先天性疾病。神经系统的癌症是由异常细胞的不受控制的扩散引起的。当神经系统中神经细胞不能正常工作时会发生退行性疾病。有证据表明，损伤可以通过用可以成熟为神经细胞的细胞衍生的新细胞(称为神经干细胞)代替丢失的细胞来逆转。然而，移植的干细胞可以并经常从植入部位迁移并经历导致畸胎瘤形成的一些细胞转化。另外，由于它们的大小，干细胞通常被直接注射到CNS中，这可引起并发症。侵入性CNS手术会使患者因分娩过程中和分娩后发生的并发症(包括但不限于出血和水肿)而面临风险。全身性施用的干细胞通常最终滞留在小毛细血管中，这可在肺中引起不希望的影响，甚至不会到达疾病或损伤。干细胞疗法也可引发不良免疫反应。
技术实现思路
本专利技术公开了神经细胞外囊泡(neuralextracellularvesicle，EV)和使用这些EV在治疗脊髓损伤、中风、外伤性脑损伤和神经退行性疾病中的方法。在一些实施方案中所公开的EV可通过以下获得：将从多能干细胞(例如人胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC))产生的神经祖(NP)细胞在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以使NP细胞产生EV，且将所述EV从培养基分离。在一些实施方案中，所述NP细胞为SOX1+、SOX2+、OCT4-和NESTIN+。在一些实施方案中所公开的EV可通过以下获得：将直接或间接从多能干细胞(PSC)(例如ESC或iPSC)衍生的神经细胞在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以产生EV，且将所述EV从培养基分离。在一些实施方案中，所述PSC-衍生的神经细胞包括神经胶质细胞，如星形细胞或少突胶质细胞。在一些实施方案中，所述PSC-衍生的神经细胞包括神经元。在一些实施方案中，所述PSC-衍生的神经细胞从衍生自hES细胞的NP细胞分化。在一些实施方案中，所述PSC-衍生的神经细胞直接从PSC分化。还公开了通过以下获得的EV，其通过将任何来源的星形细胞在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以使星形细胞产生EV，且将所述EV从培养基分离。在一些实施方案中，所公开的EV也可通过以下获得：将从PSC产生的间充质干细胞(MSC)在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以使MSC细胞产生EV，且将所述EV从培养基分离。如本专利技术所公开，由hNP细胞(在此也称为NPEX)产生的EV具有1653种未在来自干细胞-衍生的星形细胞(在此也称为APEX)或间充质干细胞(在此也称为MSCEX)的EV中识别的蛋白质(参见表9)。因此，在一些实施方案中，所述EV包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600或更多种表9中列出的蛋白生物标记物。如本专利技术所公开，由APEX产生的EV具有596种未在NPEX或MSCEX中识别的蛋白质(参见表8)。因此，在一些实施方案中，所述EV包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多种表8中列出的蛋白生物标记物。如本专利技术所公开，MSCEX产生的EV具有536种未在APEX或MSCEX中识别的蛋白质(参见表7)。因此，在一些实施方案中，所述EV包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或更多种表7中列出的蛋白生物标记物。在一些实施方案中，所公开的EV从基本上均匀的细胞群产生。在一些实施方案中，所公开的EV从未转化的细胞产生。还公开了包含所公开的EV的组合物。在一些实施方案中，所述组合物在生物相容的支架，如水凝胶中包含所公开的EV。合适的水凝胶包括：在体温固化或凝固的温度依赖性水凝胶，例如，PLURONICSTM；通过离子交联的水凝胶，例如，藻酸钠；通过暴露于可见光或紫外线而凝固的水凝胶，例如，具有丙烯酸酯末端基团的聚乙二醇聚乳酸共聚物；和在改变pH时凝固或固化的水凝胶，例如，TETRONICSTM。水凝胶可包括，例如，以下任一种：多糖、蛋白质、聚磷腈、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、乙二胺的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)、和磺化聚合物。在一些实施方案中，所述包含所公开的EV的组合物进一步包含一种或多种神经营养剂。该组合物可进一步包含一种或多种选自以下的试剂：白血病抑制因子(LIF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CTNF)、表皮生长因子受体(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-6、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CTNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、肝细胞生长因子(HGF)、IFN-γ、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-1ra、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、单核吞噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经营养因子(NT3)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)、TIMP-2、肿瘤坏死因子(TNF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-D、尿激酶纤溶酶原活化剂受体(uPAR)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、IL1-a、IL-3、来普汀、干细胞因子(SCF)、基质细胞-衍生的因子-1(SDF-1)、血小板衍生的生长因子-BB(PDGFBB)、转化生长因子β(TGFβ-1)和TGFβ-3。在一些实施方案中，所述包含所公开的EV的组合物进一步包含蛋白酶抑制剂、RNA酶抑制剂或其组合。还公开了治疗患有脊髓损伤、中风、外伤性脑损伤或神经退行性疾病的受试者的方法，包括向受试者给药有效量的包含本专利技术公开的神经EV的组合物。在一些实施方案中，所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、帕金森相关的障碍、亨廷顿病、朊病毒病、运动神经元疾病(MND)、脊髓小脑共济失调(SCA)或脊髓性肌萎缩(SMA)。在所公开的EV的内容中代表的蛋白质家族中有几种在与年龄有关的疾病的背景下是有益的。这些包括催化活性酶如金属蛋白酶、几种钙介导的信号传导蛋白和其他离子通道。存在几种DNA和RNA聚合酶亚单位以及泛素连接酶和蛋白酶体亚单位。因此，还公开了治疗患有蛋白质稳态紊乱(proteinhomeostasisdisorder)或蛋白质病的受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的含有本专利技术公开的神经EV的组合物。还公开了含有神经EV的组合物在制备用于治疗具有脊髓损伤、患有中风或外伤性脑损伤、或患有神经退行性疾病的患者或受试者的药物中的用途。在附图和下面的描述中阐述了本专利技术的一个或多个实施方案的细节。从说明书和附图以及权利要求中，本专利技术的其他特征、目的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，其包含细胞外囊泡(EV)，该细胞外囊泡(EV)通过以下获得，将来源于人多能干细胞的神经祖(NP)细胞在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以产生EV，且将所述EV从培养基分离。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.18 US 62/256,8231.一种组合物，其包含细胞外囊泡(EV)，该细胞外囊泡(EV)通过以下获得，将来源于人多能干细胞的神经祖(NP)细胞在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以产生EV，且将所述EV从培养基分离。2.权利要求1所述的组合物，其中所述人多能干细胞为胚胎干细胞。3.权利要求1所述的组合物，其中所述人多能干细胞为诱导的多能干细胞。4.权利要求1所述的组合物，其中所述神经祖细胞为SOX1+、SOX2+和OCT4-。5.权利要求1至4任一项的组合物，其中所述EVs包含表9的一种或多种蛋白生物标记物。6.一种组合物，其包含细胞外囊泡(EV)，该细胞外囊泡(EV)通过以下获得，将直接或间接从人胚胎干(hES)细胞来源的神经细胞在细胞培养基中在一定条件下培养足够的时间以产生EV，且将所述EV从培养基分离。7.权利要求6所述的组合物，其中所述神经细胞从衍生自hES细胞的神经祖(NP)细胞分化。8.权利要求6或7所述的组合物，其中所述神经细胞为神经胶质细胞。9.权利要求8所述的组合物，其中所述胶质细胞包括星形细胞。10.权利要求6至9任一项的组合物，其中所述EV包含表8的一种或多种蛋白生物标记物。11.一种组合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：SL斯蒂斯，RL韦布，TA斯蒂斯，
申请(专利权)人：佐治亚大学研究基金会，阿鲁纳生物医学股份公司，
类型：发明
国别省市：美国,US