减缓记忆力衰退和老人痴呆症的猪脑萃取物制备方法技术

本发明专利技术揭露一种减缓记忆力衰退和老人痴呆症的猪脑萃取物制备方法，其是取猪屠宰后的全脑，使用溶剂萃取配合酶水解与分子量片段筛选等步骤所制成，而获取含特定生理活性的肽序列与脂肪酸的活性物质，作为减缓记忆力衰退和老人痴呆症的用途。本方法制备的活性物质经动物模型试验证实可改善学习记忆能力与减缓老人痴呆症。本发明专利技术可提升猪脑的附加价值，减少猪脑废弃对环境造成的污染。

Preparation of porcine brain extract for slowing memory loss and Alzheimer's disease

The invention discloses a method of preparing pig brain extract to slow down memory decline and Alzheimer's disease. It is made by taking the whole brain after slaughtered by pigs, using solvent extraction, enzyme hydrolysis and molecular weight screening, and obtaining the peptide sequence and fatty acid active substance containing specific physiological activity as a slow memory. The use of decline and Alzheimer's disease. The animal model test proved that the active substances prepared by this method can improve learning and memory ability and slow down Alzheimer's disease. The invention can increase the added value of pig brain and reduce the pollution caused by pig brain waste.

【技术实现步骤摘要】
减缓记忆力衰退和老人痴呆症的猪脑萃取物制备方法
本专利技术有关于一种利用猪脑作为原料，萃取其具特定生理活性肽序列与脂肪酸的活性物质，作为减缓记忆力衰退和老人痴呆症的用途。
技术介绍
痴呆(dementia)是一种好发于老年的综合征，主要特征为患者的记忆、言语、思考及其他智能减退，是一种不可逆的大脑退化性疾病。大部分是以阿兹海默氏症(Alzheimer’sdisease；AD)为主，约占了所有痴呆的50至60％，且为目前台湾地区最主要的老年性痴呆。阿兹海默氏症(AD)是一种渐进式的神经退化性疾病(progressiveneurodegenerativedisease)，好发于老年人。根据统计，在工业化国家，患者约占总人口数2％，在欧美国家，65岁以上老人有10％患此病，在台湾则约有5％的老年人即至少有15万人罹患痴呆，而欧美国家85岁以上者，约有40％罹患阿兹海默氏症而智力受损并终致死亡，亦即发生率随着年龄的增加而增加，目前全球约有1200万人患有此病(美国约有400万人罹患阿兹海默氏症，100万人患有帕金森氏症)，其中女性又比男性较易罹患。台湾也逐渐步入高龄化社会，人口老化进而所导致的痴呆将对社会及医疗照顾产生严重的影响，已是一件不容忽视的课题，阿兹海氏默症势必将成为重大的公共健康问题。目前对于AD的致病机制有许多学者在研究(Martin,2010)，但主要的假说是以β类淀粉蛋白(Amyloidβ,Aβ)为起始者的”Amyloidcascadehypothesis”(Hardy与Selkoe,2002；Mudher与Lovestone,2002；Bossy-Wetzel等人,2004；Tanzi与Bertram,2005)，此假说中认为类淀粉沉淀物的前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)经由基因缺陷或环境因子的影响，其特定位置被一系列的位切酶(α、β和γ分泌酶)切割后，会产生介于39-43个氨基酸的肽片段(Aβ39-Aβ43)，其中以Aβ42在病理学上最为重要(Robert与Christopher,2003)，因为从AD病患的脑部皮层(cortex)与海马回(hippocampus)组织中发现最多，认为Aβ42有较强的堆积倾向与神经毒性，而Aβ大量堆积在患者脑中形成斑块的蛋白质片段(amyloidplaque)，身体清除Aβ的速率跟不上生产速率，则Aβ再引发细胞内tau蛋白过度磷酸化，过度磷酸化的tau蛋白离开微小管聚集成神经纤维缠结(neurofibrillarytangles,NET)，而根据研究指出，在AD患者神经病理上发现有颗粒空泡性退化(granulovacuolardegenera-tion)；大脑皮质(cerebralcortex)、海马回(hippocampus)及杏仁核(amygdala)这些有关记忆、学习及语言功能的组织，有大量老化斑块(senileplaqueorneuriticplaques)及神经纤维缠结(NFT)的情况发生，其中老年斑块为致病的起始者，造成神经纤维缠结、微小管因失去tau蛋白导致稳定性降低而瓦解，使细胞轴突失去支撑而退化，导致细胞死亡，进而造成脑组织逐渐萎缩、脑回变小、脑沟变宽及神经元的退化死亡(Hardy与Selkoe,2002)。脂肪酸中的二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid)[DHA,22:6(n-3)]是在脑部中含量会特别增加且主要固定在神经元细胞膜上的脂肪酸，以维持正常神经功能。然而由于海马回(hippocamous)的DHA含量会随着年纪增加与AD病症的发生而减少；并伴随着空间性学习记忆能力的降低。研究结果显示，发育中的脑部与海马回神经元可以合成并摄入DHA及混合到磷脂质的细胞膜上，并促进轴突分化，突触与神经元的新生；且n-3脂肪酸亦可促进突触的可塑性。而DHA喂饲于阿兹海默氏症或痴呆的动物模型，皆具有改善学习记忆能力与认知等现象，在海马回的细胞试验也具有同样的效果，且证实DHA在脑中某些区域确实可以扮演抗氧化物的角色，而降低痴呆发生的风险；甚至进行人体试验也发现能显著改善认知功能推迟智能退化。而Omega-3与Omega-6脂肪酸被证实能增进大脑发育的机制之一，是其能激发Syntaxin3小型膜蛋白，使神经延伸部分能生长以促成大脑发育，显示Synataxin3的辨识能够加速损伤后神经细胞修复的功效。脯氨酰内肽酶(prolylendopeptidase,PEP,EC3.4.21.26)，又称为脯氨酰内肽酶，大量分布在不同的器官，尤其是在人类的脑部，PEP属于丝氨酸蛋白酶，PEP的特异性是在脯氨酸的羧基末端水解小分子量(少于30个氨基酸)的多肽键，而许多作为神经传导物质的神经肽类物质都含有脯氨酰，譬如垂体后叶加压素、P物质、与促甲状腺释放激素等(Cunnungham与O’Connor,1997；Kalwant与Porter,1991；Odaka等人,2002)。评估阿兹海默氏症患者死后脑中的PEP含量，发现其PEP活性有显著的增加，显示PEP可能在脑中的类淀粉沉积物质起源上扮演重要的角色(Aoyagi等人,1991)。许多自然与合成的PEP抑制物显示记忆损失的大鼠因为莨菪碱的使用可以使认知的活性上升。因此特异性的PEP抑制剂具有潜力开发为抗记忆缺失的药物以治疗记忆损失与神经退化性疾病(Cunnungham与O’Connor,1997)。另外在类淀粉沉淀物前体蛋白的转基因老鼠试验也发现其在类淀粉斑块出现之前，海马回中的PEP表现会增加，且同时发生记忆受损的现象；在人类的阿兹海默氏症病患脑部也有一样的结果(RoBner等人,2005)，即类淀粉蛋白质的沉淀增加与PEP的活性及神经元损伤有一定的关系。Park等人,(2006)的研究指出，单元与多元不饱和脂肪酸中的油酸(oleicacid)、亚麻油酸(linoleicacid)、花生四烯酸(arachidonicacid)、EPA(eicosapentaenoicacid)和DHA(docosahexaenoicacid)都表现出具有PEP的抑制活性，IC50分别为23.6、43.8、53.4、99.4与46.2μM。综合上述研究结果指出某些脂肪酸都是有一定效果的PEP抑制剂，具有极佳的潜力有助于使用在学习记忆能力与神经退化性疾病的改善上。台湾畜产界以猪产量最多，除了猪肉为主要产物外，副产物中的猪脑尚无法有效利用；目前猪屠宰头数近815万头(行政院农业委员会)，猪脑约重110-130g，即每年猪屠宰后可分切出1060吨左右的猪脑，除少量作为食材外，大部分为废弃；增加业者的处理成本与环境的污染。本专利技术的预备试验中，分析猪全脑的一般成份，结果显示猪脑的蛋白质与脂质皆为10％左右，故积极评估猪脑所含的蛋白质与脂肪处理与有效利用的可行性，确认特定脂肪酸与其具有的脯氨酰内肽酶抑制活性可作为开发改善学习记忆能力与神经退化性疾病的材料。
技术实现思路
本专利技术人有鉴于目前猪脑在猪屠宰过程中无法被有效利用而导致废弃污染的问题，以及过去研究与文献指出特定的脂肪酸与肽有助于改善神经退化性疾病的成效，因此才思及专利技术创作的意念，于是本着锲而不舍的精神，积极不断地加以研究改良，并经本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种减缓记忆力衰退和老人痴呆症的猪脑萃取物制备方法，其包含以下步骤：(a)加水绞碎混合：取猪屠宰分切后的猪脑加1倍量纯水、蒸馏水或逆渗透水进行绞碎混合动作；(b)水浴加热：经混合均匀后以100℃沸水浴加热15分钟；(c)溶剂萃取：再以猪脑10倍量的溶剂搅拌萃取24小时；(d)减压浓缩：萃取液经滤纸过滤后以减压浓缩机于50℃去除溶剂；(e)酶进行水解：以酶基质比1:80将蛋白质酶加入浓缩液，在震动频率300rpm的往覆式循环水槽中水解12小时；(f)水浴加热以停止酶反应：接着以100℃沸水浴加热5分钟终止酶反应(失活)；(g)流水冷却：再以25℃流水冷却15分钟，使其温度降至大约25℃；(h)离心机分离：在25℃下以离心机10000×g离心20分钟后移除下层物质，留取上层液体；(i)超过滤：以过滤膜进行分子量1～5kDa片段筛选的超过滤；(j)冷冻干燥：最后的过滤液以冷冻干燥机在压力0.1至0.2托下冷冻干燥96小时，收集的干燥粉末。

【技术特征摘要】
1.一种减缓记忆力衰退和老人痴呆症的猪脑萃取物制备方法，其包含以下步骤：(a)加水绞碎混合：取猪屠宰分切后的猪脑加1倍量纯水、蒸馏水或逆渗透水进行绞碎混合动作；(b)水浴加热：经混合均匀后以100℃沸水浴加热15分钟；(c)溶剂萃取：再以猪脑10倍量的溶剂搅拌萃取24小时；(d)减压浓缩：萃取液经滤纸过滤后以减压浓缩机于50℃去除溶剂；(e)酶进行水解：以酶基质比1:80将蛋白质酶加入浓缩液，在震动频率300rpm的往覆式循环水槽中水解12小时；(f)水浴加热以停止酶反应：接着以100℃沸水浴加热5分钟终止酶反应(失活)；(g)流水冷却：再以25℃流水冷却15分钟，使其温度降至大约25℃；(h)离心机分离：在25℃下以离心机10000×g离心20分钟后移除下层物质，...

【专利技术属性】
技术研发人员：林亮全，柳育泽，
申请(专利权)人：嘉顶生技股份有限公司，林亮全，柳育泽，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71