在受损神经系统中维持神经细胞的营养培养基技术方案

提供了一种在脑或脊髓损伤或手术后提高人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力的方法。该方法包括对脑或脊髓组织施用含水的无菌液体培养基，其中所述含水的无菌液体培养基含有０－约３０００μＭ　　ＣａＣｌ↓［２］、约０．１－约１．２μＭ　　Ｆｅ（ＮＯ↓［３］）↓［３］、约２５００－约１００００μＭ　　ＫＣｌ、０－约４０００μＭ　　ＭｇＣｌ↓［２］、约３００００－约１５００００μＭ　　ＮａＣｌ、约１００－约３００００μＭ　　ＮａＨＣＯ↓［３］、约２５０－约４０００μＭ　　ＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］、约０．０１－约０．４μＭ亚硒酸钠、约０．２－约２μＭ　　ＺｎＳＯ↓［４］、约２５００－约５００００μＭ　　Ｄ－葡萄糖、约１－约５０μＭ　　Ｌ－肉碱、约３－约８０μＭ乙醇胺、约１５－约４００μＭ　　Ｄ（＋）－半乳糖、约４０－约８００μＭ腐胺、约２０－约５００μＭ丙酮酸钠以及对神经元生长有效的量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种维持经照射、受损或分离的神经细胞生存力的经过改进的含水培养基。本专利技术还涉及维持经照射、受损或分离的神经细胞生存力的改进方法。本专利技术还涉及将这种改进的培养基用于人类患者神经外科的方法。
技术介绍
研究受损中枢神经系统组织的主要问题是维持细胞生存力。无法在各种环境条件下使维持中枢神经系统组织的生存力在培养物中维持较长时间，这曾经阻止了治疗中枢神经系统疾病的有效治疗方案的发展。最近开发了一种在高二氧化碳气氛(5％CO2)下维持中枢神经系统组织生存力的营养平衡盐溶液(培养基)。NeurobasalTM(Gibco/Invitrogen股份有限公司，Rockville，MD)是能使胚胎大鼠海马神经元在pH 7.3、5％ CO2下生长最优的碳酸氢盐缓冲培养基。该培养基是Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)的衍生物并可优化胚胎大鼠海马细胞的存活率。与DMEM相比，NeurobasalTM含较少NaCl和NaHCO3，这使其渗量降低并含有较少量的半胱氨酸和谷氨酰胺，从而导致神经胶质生长降低。此外，NeurobasalTM含有丙氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和维生素B12，而这些DMEM都不含有。尽管神经元可在5％CO2气氛下保持在高碳酸氢盐培养基中，当添加B27(一种获自Invitrogen公司的激素和抗氧化剂添加物)时，当转移到环境CO2条件(约0.2％)时神经元迅速死亡。死亡与培养基pH迅速升高至约8.1有关。制造和研究神经组织和细胞通常需要在培养箱外使用环境CO2水平。现有控制培养箱外细胞pH的方法包括使用弱缓冲液(如Dulbecco改进的Eagle培养基或L 15培养基中使用的缓冲液)并用5-10％CO2连续吹气以维持生理pH。然而，一个简单的试验显示，环境CO2会使培养箱外DMEM的pH迅速升高至约8.1。通常用HEPES缓冲的做法会减慢，但不能阻止这种实质性的碱化。对组织连续吹气的做法可保持高CO2水平和生理pH，但设备笨重且成本昂贵。美国专利6,180,404(2001.1.30)，该专利属于本申请相同受让人并被并入以供参考，提供了在环境CO2条件下维持神经细胞的培养基。所述培养基含有少于约2000μM碳酸氢盐(pKa为约6.9-约7.7的缓冲液)、0-约3000μM CaCl2、约0.05-约0.8μM Fe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl，0-约4000μM MgCl2、约74000-约103000μM NaCl、约400-约2000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖和约20-约500μM丙酮酸钠，且其中所述培养基基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。这种培养基的一种形式可以商品名HibernateTM购得。优选地，这种培养基添加有B27(一种含有效量激素的促进生长的添加物)、必需脂肪酸和抗氧化剂以使神经细胞生长。该领域还需要一种改进的培养基，这种培养基可维持生理pH，并可在受损的脑和脊髓组织中提供高神经细胞生存力，在受损的脑和脊髓组织中，受到损伤的血液供应会减少CO2和其它营养物、激素和/或促进再生和/或防止或显著降低退化的生长因子。本专利技术提供了这种改进的培养基。脑肿瘤是15岁以下儿童和34岁以上青年中的第二大致死肿瘤。脑肿瘤是65岁以上成年中第二大发展最快的致死肿瘤。与许多其它肿瘤不同，行为改变似乎不会显著降低诸如脑肿瘤的风险。尽管约40％或50％的脑癌是良性的，但良性脑癌也会导致显著损伤和死亡。美国每年约有100,000人被诊断患有原发性或转移性脑肿瘤。只要肿瘤部位许可，通常可用外科手术技术来除去脑肿瘤。手术部位(即蛛网膜下隙、脑薄壁组织和切除腔)通常用生理盐水冲洗，有时还要用浸在生理盐水中的物质包扎。因此，就需要有可用于神经外科以提高神经细胞生存力和/或促进神经细胞再生和/或促进神经细胞分化的改进培养基和方法。这种改进的培养基和方法可用来冲洗或浸泡手术位置和/或用来浸渍或浸透填料(例如，明胶-泡沫海绵)，所述填料在除去肿瘤或其它神经组织后仍留在腔内。本专利技术提供了这种改进的培养基和方法。专利技术概述一方面，本专利技术提供了一种在脑或脊髓损伤或手术后提高人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力的方法，所述方法包括对脑或脊髓组织施用无菌含水液体培养基，其中所述含水的无菌液体培养基含有0-约3000μM CaCl2、约0.1-约1.2μMFe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl、0-约4000μM MgCl2、约30000-约150000μMNaCl、约100-约30000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.01-约0.4μM亚硒酸钠、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖、约1-约50μM L-肉碱、约3-约80μM乙醇胺、约15-约400μM D(+)-半乳糖、约40-约800μM腐胺、约20-约500μM丙酮酸钠以及神经元生长有效量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。所述无菌液体培养基还可含有有效量的脱氢表雄酮-4-硫酸盐(DHEAS)以维持激素水平；通常，有效量的DHEAS是约2-约200μM，更优选约5-约100μM。所述无菌液体培养基还可含有有效量的碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF或FGF2)以协助支持神经元的存活和再生；通常有效量的FGF2是约1-约50ng/ml，更优选约2-约20ng/ml。特别优选用于本专利技术的FGF2是获自Invitrogen有限公司(Rockville，MD)的碱性人重组成纤维细胞生长因子。更优选地，所述无菌液体培养基含有有效量的DHEAS和FGF2。这种优选的组合物通常含有约5-约50μM DHEAS和约1-约50ng/ml FGF2，更优选约10-约30μM DHEAS和约2-约20ng/ml FGF2。另一方面，本专利技术提供了一种将生存力增强的干细胞或神经系统细胞或组织输递入人的脑、脊髓或神经系统的方法，所述方法包括(1)在将干细胞或神经系统细胞或组织输递入人的脑、脊髓或神经系统之前或之时用含水的无菌液体培养基处理所述干细胞或神经系统细胞或组织，和(2)输递经处理的干细胞或神经系统细胞或组织至人的脑、脊髓或神经系统，其中所述含水的无菌液体培养基含有0-约3000μM CaCl2、约0.01-约1.2μM Fe(NO3)3、约2500-约10000μM KCl、0-约4000μMMgCl2、约30000-约150000μM NaCl、约100-约30000μM NaHCO3、约250-约4000μM NaH2PO4、约0.01-约0.4μM 亚硒酸钠、约0.2-约2μM ZnSO4、约2500-约50000μM D-葡萄糖、约1-约50μM L-肉碱、约3-约80μM 乙醇胺、约15-约400μM D(+)-半乳糖、约40-约800μM 腐胺、约20-约500μM 丙酮酸钠，和对神经元生长有效的量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，其中所述无菌液体培养基的渗量为约200-约270mOs本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在脑或脊髓损伤或手术后提高人类脑或脊髓组织中神经细胞生存力的方法，其特征在于，所述方法包括对脑或脊髓组织施用含水的无菌液体培养基，所述含水的无菌液体培养基含有０－约３０００μＭＣａＣｌ↓［２］、约０．１－约１．２μＭＦｅ（ＮＯ↓ ［３］）↓［３］、约２５００－约１００００μＭＫＣｌ、０－约４０００μＭＭｇＣｌ↓［２］、约３００００－约１５００００μＭＮａＣｌ、约１００－约３００００μＭＮａＨＣＯ↓［３］、约２５０－约４０００μＭＮａＨ↓［２］ＰＯ ↓［４］、约０．０１－约０．４μＭ亚硒酸钠、约０．２－约２μＭＺｎＳＯ↓［４］、约２５００－约５００００μＭＤ－葡萄糖、约１－约５０μＭＬ－肉碱、约３－约８０μＭ乙醇胺、约１５－约４００μＭＤ（＋）－半乳糖、约４０－约８００ μＭ腐胺、约２０－约５００μＭ丙酮酸钠以及对神经元生长有效的量的促进生长必需的脂肪酸、激素和抗氧化剂，所述无菌液体培养基的渗量为约２００－约２７０ｍＯｓｍ，含有约５０００－约２５０００μＭ氢离子缓冲液，缓冲液的ｐＫａ为约６．９－约７．７，且基本上不含硫酸亚铁、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：GJ布鲁尔，
申请(专利权)人：南伊利诺斯州立大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]