用于定量糖组学的体内同位素标记方法技术

本发明专利技术涉及同位素标记聚糖和促进生物细胞的糖组学组合物的高通量定量／比较分析的方法。该方法尤其适用于辨别分化细胞和它们的糖组学特征、分化情况、疾病和／或治疗进展，诊断疾病状态，确定药物活性，建立制造效率和确定细胞中聚糖的半衰期。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及同位素标记聚糖和促进生物细胞的糖组学(glycomic)组合物的高通 量定量/比较分析的方法。优先权要求和资金支持本申请要求2007年10月29日提交的美国临时申请流水号61/000，920的优先 权，其名称为 “IDAWG A novel quantitative method for glycomics-IDAWG”，其整个内容 以其整体在此引入作为参考。本专利技术得到政府的支持，其资金号为NIH/NCRR 5P41RR018502和NIH/NIDDK 1R01DK075069,由NIH授予。因而，美国政府对本专利技术具有某些权利。
技术介绍
已开发了一系列策略以用于大规模体系的高通量(throughput)定量/比较分析， 以使得可比较不同生物状态之间各种分子的表达水平。在_组学领域，蛋白质组学领域使 用的技术可能是最成熟的，且可广泛细分为两个一般流程-涉及使用标记的方法和不使用 标记的方法。在不使用标记的方法中，肽/蛋白质的不同方面，如标准化的离子强度、光谱 计数、质量、扫描数和信号强度，以及精确质量加保留时间已成功用于指定蛋白质表达水平 以进行对比研究H。然而，各分析物的离子化效率取决于以下因素，如其分子量、质子/阳 离子亲和力、表面活性、与分析物的离子化竞争或干扰分析物的离子化的其它化合物的存 在等，因此离子的强度不直接与浓度相关。此外，仪器的响应可随时间改变，因此源自两项 或更多项分析的数据的直接比较可产生显著不同的结果。相对定量的备选策略通过同时分 析几对同位素标记的群体克服了这些问题，其提供了以下优点，即重和轻标记的肽对在完 全相同的条件下分析，使得可直接比较该肽的相对丰度。同位素标记的群体之间的相对定 量通过计算轻和重单同位素峰的面积或强度的比例而进行。已开发了众多策略用于将稳定的同位素引入蛋白质群体5_12。例如，同位素-编码 的亲和标签(ICAT)化学靶向肽序列中的特定氨基酸，通常为半胱氨酸，用于差别标记5。其 它体外方法也靶向多肽的官能团6’8—12。也可通过代谢标记将稳定的同位素引入生物体系。 例如，在细胞培养物中用氨基酸进行的稳定同位素比较(SILAC)提供了简单且直接的方法 以在基于MS的蛋白质组学之前向蛋白质体内引入同位素标记物7。在SILAC实验中，两个 细胞群在培养基中生长，该培养基相同除了其中之一包含“轻”而另一个包含“重”形式的 特定氨基酸(例如12C和13C标记的赖氨酸和精氨酸)。将该标记的氨基酸类似物代替天然 氨基酸供给培养中的细胞，且其实现掺入所有新合成的蛋白质。在大量细胞分裂后，特定氨 基酸的各实例由其同位素标记的类似物替换。该方法优于体外方法的一个优点为，在细胞 裂解后细胞立即混合在一起。因此，来自两种类型细胞的蛋白质在样品处理、消化、纯化等 过程中都经受完全相同的实验条件，其消除了当样品以平行方式分开处理时会发生的差别 损耗。因此，SILAC通常被认为是定量蛋白质组学分析的“黄金标准” 13。比较糖组学的领域不像蛋白质组学一样成熟；然而多种定量的蛋白质组学工具已 适用于糖组学分析。例如，总离子作图(total ion mapping) (TIM)为不使用标记的方法，其基于碎片离子强度的总和确定聚糖个体相对样品中所有聚糖总量的流行率和百分数，且 有些方面类似于蛋白质组学使用的不使用标记的方法14。体外同位素标记也已通过众多团 队进行了开发。对于N-连接的聚糖和游离寡糖，已得到多种含同位素的标签以标记还原端 15_18。0-连接的聚糖通常通过β-消除从蛋白质主链释放，因此不适合这些方法。然而，已 开发了依赖β-消除以将质量标记引入聚糖的定量方法19。比较同位素标记寡糖的另一种 建议的方法依赖于标准全甲基化过程中的重碘甲烷(13CH3,12⑶H2,12CHD2，和/或12CD3)相对 轻碘甲烷(12CH3)的标记，其为MS分析N-连接的和0-连接的聚糖之前常用的衍生化步骤 (14’2°’21。此外，已为N-和0-连接的聚糖开发了同量异位(isobaric)标记策略，其使用用 13CH3和12⑶H2进行的全甲基化，且对于异构混合物中存在的聚糖个体的定量特别有用22’23。 所有这些体外方法对于糖组学是有用的工具。附图简述图IA图示了己糖胺生物合成途径，其将糖酵解中间体果糖-6-磷酸转化为 UDP-GlcNAc。图IB显示用于在有或没有重Gln的情况下标记鼠ES细胞，然后从蛋白质分离 N-和0-连接的聚糖用于质谱分析的分离和分析步骤的流程图。图2显示从在14Gln或15NGln中生长的mESCs释放的全甲基化的N-连接的聚糖的 全光谱。图3显示对由GlcNAcsMar^聚糖产生的双电荷分子离子(M+2Na)2+的更密切的检 查，其出现在距14N和15NGln培养基中生长的聚糖的1005. 5和1006. 5m/z单位处。图4A和4B显示重和轻标记的核心岩藻糖基化的、完全唾液酸化的 (fullysialyated)、双触角N-连接的聚糖的碎裂显示的碎片与15N-掺入Neu5Ac以及核心 和触角GIcNAC残基一致。图5A-F说明将15N掺入到0-聚糖中包含的所有氨基糖中，对于包含GIcNAC和 Neu5Ac的O-Man引发的聚糖、包含GlcNAc的O-GalNAc引发的结构和含两个Neu5Ac残基的 O-GalNAc引发的结构显示碎裂后重和轻分离的样品的MS/MS光谱。图6显示表1，其表明按照本文所述的本专利技术15N标记N-聚糖的高标记效率。
技术实现思路
本专利技术涉及同位素标记聚糖的方法。该方法用于促进生物物质(尤其包括细胞和 组织)的糖组学组合物(glycomic compositions)的高通量定量/比较分析。本专利技术涉及利用对细胞培养物中聚糖进行稳定的同位素(15N)标记以进行相对定 量的糖组学的方法。该方法称为用谷氨酰胺同位素检测氨基糖(IDAWG)，其依赖于己糖胺的 生物合成途径，该合成途径使用谷氨酰胺的侧链作为其在糖核苷酸的产生中氨基糖的氮的 唯一供体源。因此，例如，向其它无Gln的培养基引入重谷氨酰胺(15N)(作为单体、二聚或 多聚的谷氨酰胺和它们药学可接受的盐)可使得所有氨基糖被标记且质量位移+1道尔顿。本专利技术涉及用于重(同位素)标记细胞或组织培养物中的复合糖的体系以促进定 量的糖组学。该方法依赖于以下事实，即众多细胞或组织培养物体系需要添加内源性Gln， 且Gln是己糖胺生物合成途径中氨基糖的唯一氮供体。因此，假设且显示，如果在培养基中 使用在侧链(酰胺基)具有15N的重Gln，则包含GlcNAC、GalNAC和唾液酸的复合糖快速将重氮掺入这些单糖的每一种中。然后将重谷氨酰胺中生长的细胞、组织和其它生物物质分 离、提取等以得到包含聚糖的肽和脂质，将它们定量和定性分析。该方法可用于评判聚糖半 衰期，在两份细胞或组织培养物样品之间进行相对定量，并辅助聚糖检测、表征(聚糖的类 型以及任选的聚糖缀合的肽或脂质的类型)和验证。因此，使用本方法，可测定分化、疾病 或病症、药物、激素或环境因素对聚糖的数量和质量的影响并诊断性和治疗性使用以辨别 分化过程中聚糖的变化，诊断疾病状态，监测治疗和测定药物、激素和环境对生物物质尤其 是培养的细胞和组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
与对照样品相比，比较受调节的生物样品中一种或多种感兴趣的聚糖的相对丰度的方法，其包括：将待调节的第一生物样品在进一步包含↑［１５］Ｎ－谷氨酰胺的第一培养基中培养；将对照样品在与所述第一培养基相同且进一步包含↑［１４］Ｎ－谷氨酰胺的第二培养基中培养；在培养过程中调节所述第一样品；加工所述第一样品和所述对照样品以从它们提取蛋白质和／或脂质；在所述加工步骤后从所述样品分离所述蛋白质和／或脂质；任选将所述蛋白质消化为多个肽；任选从所述蛋白质、肽和／或脂质释放聚糖且从所述蛋白质、肽和／或脂质分离所述释放聚糖；将所述蛋白质、所述肽、所述脂质和／或所述聚糖进行质谱分析以得到质谱；和基于所述质谱确定各样品的感兴趣的所述聚糖的相对丰度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特L韦尔斯，罗纳德C奥兰多，斯蒂芬达尔顿，凯利W莫雷曼，J迈克尔皮尔斯，詹姆斯A阿特伍德，迈克尔蒂迈耶，威廉S约克，
申请(专利权)人：佐治亚大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]