一种神经干细胞制剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种神经干细胞制剂，其包括脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞和间充质干细胞分泌的外泌体，所述的神经干细胞和所述的外泌体的配比为(6‑8)×106神经干细胞﹕100μg外泌体。本发明专利技术还公开了所述神经干细胞制剂的制备方法、含所述神经干细胞制剂的药物组合物、神经干细胞制剂在治疗肌萎缩侧索硬化症中的应用以及药物组合物在治疗肌萎缩侧索硬化症中的应用。间充质干细胞诱导的神经干细胞通过自我更新修复神经系统，外泌体可调节免疫和缓解神经毒性，二者联用可以进一步促进移植神经干细胞发挥有效作用，更好地治疗肌萎缩侧索硬化症。

Preparation of neural stem cell and preparation method and application thereof

The invention discloses a neural stem cell preparation, which comprises a secretory body of neural stem cells and mesenchymal stem cells induced by umbilical cord mesenchymal stem cells. The ratio of the neural stem cells and the secretory body is (6_8)*106 neural stem cells: 100 mg exosome. The invention also discloses the preparation method of the neural stem cell preparation, the pharmaceutical composition containing the neural stem cell preparation, the application of the neural stem cell preparation in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis and the application of the pharmaceutical composition in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis. Neural stem cells induced by mesenchymal stem cells repair the nervous system by self-renewal. Exosomes can regulate immunity and alleviate neurotoxicity. The combination of the two can further promote the transplantation of neural stem cells to play an effective role in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis.

【技术实现步骤摘要】
一种神经干细胞制剂及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物制剂领域，尤其涉及一种神经干细胞制剂及其制备方法和应用。
技术介绍
肌萎缩侧索硬化症(AmyotrophicLateralSclerosis,ALS)是一种致命性神经系统变性疾病，由于上、下运动神经元变性导致延髓、四肢、躯干、胸部及腹部肌肉逐渐无力和萎缩，患者常在症状出现后3-5年内因呼吸肌麻痹而死亡。ALS作为最常见的运动神经元疾病，其年发病率为(2-3)/10万，其中家族性ALS约占5％-10％，散发性ALS占90％-95％。ALS以上运动神经元变性(主要特征为腱反射亢进、肌张力增高)和下运动神经元变性(肌萎缩、肌无力、束颤和腱反射失)为主要症状与体征。随着神经影像学、神经心理学等诊断技术的发展，发现认知功能受损亦是ALS的常见特征。根据发病部位可分为肢体发病(占65％)、延髓发病(30％)，极少数患者以呼吸系统症状、体质量减轻和孤立性情感不稳定为首发症状与体征。根据上下运动神经元受累的程度，可分为肌萎缩侧索硬化症、原发性侧索硬化(PLS)、进行性脊肌萎缩(PSMA)和进行性延髓麻痹(Progressivebulbarpalsy)等类型。目前ALS的发病机制仍不明确，主要有神经兴奋性氨基酸毒性、氧化应激、线粒体异常、基因突变、神经营养因子不足和免疫炎症等。应用利鲁唑(Riluzole)可使肌萎缩侧索硬化患者的生存期延长数月，是目前惟一被美国FDA批准的临床药物，但价格昂贵且无法治愈疾病。其他治疗措施包括抗氧化和自由基清除药、神经营养因子及基因治疗等，但尚无确切效果。近年来，神经干细胞的发现及其神经修复理论的完善为该病的治疗提供了新思路。目前实验及临床研究进展表明神经干细胞移植能够提高一定的治疗效果。但神经干细胞主要从胚胎干细胞诱导或是直接从发育中的中枢神经系统分离获得，存在伦理学、安全性问题及细胞来源和数量有限等问题。因此，寻找其他能获得神经干细胞的途径尤为重要。脐带/脐血来源的间充质干细胞在适当的诱导条件下可以多向分化为间质谱系内的各种细胞，跨系分化为外胚层的神经细胞及内胚层的肝细胞。但间充质干细胞增殖速度、分化方向的调控，移植后融入相应的组织器官并发挥特定功能、分化过程中细胞生长因子的具体作用机制、相互之间存在的影响等问题仍未知，且间充质干细胞存在致瘤性。因此目前施用间充质干细胞治疗肌萎缩侧索硬化效果不佳，可能是由于ALS患者脑内一定神经毒性，削弱间充质干细胞定向分化和神经系统修复能力。也有使用外泌体治疗ALS患者的少量报道，但其效果同样不佳，单纯使用外泌体或者神经营养因子不能有效逆转已受损神经元，且外泌体的提取纯化步骤复杂繁琐，现有商品化试剂盒价格昂贵，因此有碍科学研究和临床试验的开展。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中单独施用间充质干细胞治疗肌萎缩侧索硬化效果不佳的缺陷，提供了一种含脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞和外泌体的神经干细胞制剂及其制备方法和应用。通过本专利技术发现，体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞，并进行鉴定，可保证间充质干细胞的定向分化。且研究表明干细胞免疫调节和神经修复的功能主要是通过分泌的细胞因子和外泌体。将脐带间充质干细胞分泌的外泌体进行分离、纯化与其诱导的神经干细胞共同制成细胞悬液，对ALS患者能起到促进神经元生成、分泌神经营养因子、降低谷氨酸神经毒性、促使血管重建等作用。通过本专利技术的实施例，可以看出在NSC移植治疗7周后患者的脑脊液中谷氨酸和磷酸化神经丝重链(pNfH)水平下降，胱蛋白酶抑制剂C(CyC)水平有所恢复，依据肌萎缩侧索硬化功能评分量表，NSC移植后患者肢体症状和活动得到明显改善。因此本专利技术可以直接阻止脑损伤进程或促进损伤神经的再生，有效解决上述
技术介绍
中的问题。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种神经干细胞制剂，其包括脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞和间充质干细胞分泌的外泌体，所述的神经干细胞和所述的外泌体的配比为(6-8)×106神经干细胞﹕100μg外泌体。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种神经干细胞制剂的制备方法，其包括以下步骤：(1)将脐带间充质干细胞诱导培养分化成神经干细胞，分离制备成细胞悬液；(2)从脐带间充质干细胞获得外泌体；(3)将所述的神经干细胞和所述的外泌体按(6-8)×106﹕100μg的配比混合。所述间充质干细胞细胞诱导培养2周后观察，发现细胞表面突起增多，且有聚集成一定细胞球，可见出现神经干细胞球样生长。现有移植间充质干细胞治疗肌萎缩侧索硬化症的技术中，未见将神经干细胞诱导成神经球的记载。优选地，步骤(1)中取第3代脐带间充质干细胞在含250μg/LBDNF和10μg/LbFGF的DMEM/F12培养基中诱导培养2周。更优选地，所述神经干细胞的活性>95％，内毒素<2EU/mL，CD133阳性率≥40％和nestin阳性率≥90％。进一步更优选地，步骤(2)中将脐带间充质干细胞贴壁后静置培养7天，收集培养上清液，然后超速离心法分离纯化得到所述外泌体。优选地，所述超速离心法包括以下步骤：(1)低温2500～5000×g离心，除去细胞及其碎片；(2)继续100,000～120,000×g离心，弃上清，加缓冲液重悬底部沉淀；(3)再次100,000～120,000×g离心，弃上清。上述的低温在本领域通常指10℃以下，较佳选择离心设备设置的温度即为4℃。优选地，所述步骤(1)的离心速度为3000×g，离心时间10min；步骤(2)重复一次；所述缓冲液为PBS缓冲液；和/或所述步骤(2)或(3)的离心速度为110,000×g，离心时间70min。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：含所述神经干细胞制剂的药物组合物。优选地，其给药方式为注射给药。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：所述药物组合物在制备治疗肌萎缩侧索硬化症的药物中的应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：所述神经干细胞制剂在制备治疗肌萎缩侧索硬化症的药物中的应用。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：1)充分利用脐带间充质干细胞易获得、易分离、易分化和免疫调节等特性，应用脐带源神经干细胞移植来阻止或延缓ALS的进展；2)对比脐血源神经干细胞，脐带源神经干细胞分离和分化方法更简洁，细胞性质更稳定；3)间充质干细胞分泌的外泌体有免疫调节和修复神经细胞的功能，因此脐带源神经干细胞移植后通过分析病人脑脊液中分子水平就可对诊断和效果做出便捷的评估；4)颈部和上肢肌群肌力评分，流涎、吞咽、穿衣和卫生及行走评分，神经干细胞球+外泌体联合施用的方案效果明显优于神经干细胞、外泌体单独施用的方案，所以本专利技术可以有效阻止肌萎缩侧索硬化症疾病进程或促进损伤神经的再生。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞的制备可以采用现有技术[(1)Matrixcellsfr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种神经干细胞制剂，其特征在于，其包括由脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞和间充质干细胞分泌的外泌体，所述的神经干细胞和所述的外泌体的配比为(6‑8)×106神经干细胞﹕100μg外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种神经干细胞制剂，其特征在于，其包括由脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞和间充质干细胞分泌的外泌体，所述的神经干细胞和所述的外泌体的配比为(6-8)×106神经干细胞﹕100μg外泌体。2.一种神经干细胞制剂的制备方法，其包括以下步骤：(1)将脐带间充质干细胞诱导培养分化成神经干细胞，分离制备成细胞悬液；(2)从脐带间充质干细胞获得外泌体；(3)将所述的神经干细胞和所述的外泌体按权利要求1所述的配比混合。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中取第3代脐带间充质干细胞在含250μg/LBDNF和10μg/LbFGF的DMEM/F12培养基中诱导培养2周。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述神经干细胞的活性>95％，内毒素<2EU/mL，CD133阳性率≥40％和nestin阳性率≥90％。5.如权利要求2～4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨涛，曹婷，余波，
申请(专利权)人：上海市浦东医院，
类型：发明
国别省市：上海,31