利用突变蛋白检测β-内酰胺类抗生素残留的方法技术

本发明专利技术属于兽药残留分析技术领域。具体涉及利用突变蛋白检测β‑内酰胺类抗生素残留的方法。该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1，在序列的55,70和563‑564位存在等位基因突变。公开了如SEQ ID NO：2所示蛋白质序列的突变蛋白同时对40种β‑内酰胺类抗生素残留的检测方法，包括：突变位点的设计，构建突变蛋白，对突变蛋白进行诱导表达及纯化，利用突变蛋白建立β‑内酰胺类抗生素残留的检测方法。本发明专利技术对35种β‑内酰胺类抗生素测定方法提供了最低检测限、样品回收率及变异系数等技术参数，对本发明专利技术的检测方法做了准确度和重复性验证分析，本发明专利技术能同时检测35种动物性食源产品中β‑内酰胺类抗生素的残留量。

【技术实现步骤摘要】
利用突变蛋白检测β-内酰胺类抗生素残留的方法
本专利技术属于兽药残留分析
具体涉及利用突变蛋白检测β-内酰胺类抗生素残留的方法。本专利技术能同时检测同时检测35种动物性食源产品中β-内酰胺类抗生素残留量。
技术介绍
β-内酰胺类抗生素是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素。近50年来，β-内酰胺类抗生素被用做畜禽的预防、治疗以及促生长。在现代农业生产中，动物性食品中该类抗生素的添加以及对生长发育的预防性治疗被认为是必不可少的。然而由于该类抗生素的使用不当或滥用造成在动物体内的残留，这危害到动物食品安全及人类健康。世界各国对抗生素的残留有高度的关注，在动物饲养、生产及销售过程中，制定各种相关法律法规来规定抗生素的使用及残留检测。目前β-内酰胺类抗生素已有多种检测方法存在，主要为微生物法、理化分析法、免疫分析法及受体分析法(Ahmedetal.,2017)。微生物学分析法基于抗生素对微生物生理机能和代谢的抑制作用，大多选用枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和藤黄八叠球菌等敏感菌株等作为检测指示菌，该方法操作简单、价格低廉，适用于基层大量样品的筛选(Ferrinietal.,2008)，但存在检测时间长、稳定性差等缺点，因此很难实现标准化定量检测。理化分析法对抗生素进行定量或定性分析，准确性高，灵敏度高，但需要昂贵的仪器和专业的技术，而且前处理程序复杂，不适合基层样品大规模的筛选(Gaudinetal.,2001)。免疫分析法是以抗原抗体的特异性、可逆性结合为核心反应的分析方法，该方法具有快速简便、灵敏度高、特异性强、处理量大等特点，但其中抗体制备技术较为复杂，且由于抗体的特异性高，只能同时检测一种或少数几种抗生素。抗生素受体分析法是基于抗生素和受体之间的特异性识别反应的分析方法，可以同时特异性识别含有具有活性的β-内酰胺环的青霉素类和头孢菌素类抗生素，从而实现抗生素的多残留检测(程古月etal.,2014)。目前受体分析法在抗生素的残留检测中应用较多，如β-内酰胺类(Chenetal.,2015,Pazzolaetal.,2015)、四环素(Moelleretal.,2007)、氯霉素、磺胺类(Gaudinetal.,2012,Liangetal.,2013)等抗生素。该技术应用于β-内酰胺类抗生素的残留检测中的受体蛋白主要种类较多，其中来自肺炎链球菌的PBP2x重组蛋白(Zengetal.,2013)可用于检测牛奶样品中的15种β-内酰胺类抗生素，来自肺炎链球菌的PBP3重组蛋白(张静2015)可用于检测牛奶样品中的27种β-内酰胺类抗生素，最低检测限(LimitofDetection,LOD)为0.26-109.46μg/kg。本申请人所在的华中农业大学国家兽药残留基准实验室前期研究了β-内酰胺类抗生素受体的筛选及ELISA试剂盒研制，构建了原核表达载体pET-28a(+)-BlaR-CTD，表达并纯化得到高纯度的BlaR-CTD蛋白，以该蛋白为受体建立了牛奶、牛肉、鸡肉组织中β-内酰胺类抗生素残留的检测方法，头孢喹肟的LOD为0.43μg·L-1，低于欧盟和我国的MRL(Pengetal.,2013)。然而该研究中蛋白对氯唑西林、头孢氨苄、头孢羟氨苄的亲和力较差，且蛋白的稳定性较差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，通过定点突变对BlaR-CTD进行结构的改造，提高该蛋白的亲和力及稳定性，建立一种能适用于多种可食性动物产品中β-内酰胺类抗生素的多残留的检测方法。本专利技术的蛋白可应用于，当组织样品中的β-内酰胺类抗生素种类为已知时，可以对其进行半定量分析。为了实现本专利技术的任务，专利技术人在原核表达载体pET-28a(+)-BlaR-CTD的基础上对BlaR-CTD蛋白进行结构改造(本专利技术中的突变蛋白，来自于地衣芽孢杆菌的基因体外整合到pET-28a质粒后，再转化到大肠杆菌中，也就是说该突变蛋白已经整合到大肠杆菌，利用本专利技术保藏的大肠杆菌KCC就是利用了其中的突变蛋白)，获得突变蛋白的原核表达载体pET-28a(+)-BlaR-CTD-I188K-S19C-G24C，申请人将含有该表达载体pET-28a(+)-BlaR-CTD-I188K-S19C-G24C的大肠杆菌命名为大肠杆菌KCC，EscherichiacoliKCC，于2018年3月16日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO:M2018132。本专利技术提供了一种基于BlaR-CTD突变蛋白的同时检测40种β-内酰胺类抗生素残留的方法，它包括构建BlaR-CTD突变蛋白，突突变蛋白的诱导表达及纯化，建立β-内酰胺类抗生素残留检测方法，利用突变蛋白检测β-内酰胺类抗生素，所述方法的具体步骤包括：(1)以原核表达载体pET-28a(+)-BlaR-CTD为模板，利用突变引物(突变引物的序列如序列表SEQIDNO:3-8所示)进行PCR扩增，得到突变质粒pET-28a(+)-BlaR-CTD-I188K-S19C-G24C，转化大肠杆菌BL21感受态细胞后，得到保藏编号为CCTCCNO:M2018132突变的大肠杆菌KCC；(2)当步骤(1)得到突变的大肠杆菌的OD600为0.6时，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，18℃恒温振荡培养12h，对该蛋白进行诱导表达，收集菌液后超声破碎，取上清进行纯化，得到高纯度突变蛋白I188K-S19C-G24C；(3)将步骤(2)所得的高纯度突变蛋白I188K-S19C-G24C包被于酶标板上，优化反应条件后进行检测，考察检测方法的精密度、灵敏度和特异性；(4)将步骤(3)建立的检测方法应用于各种可食性动物样品的检测，测定最低检测限，样品回收率及变异系数，考察方法的准确度和重复性。本专利技术的主要优点如下：1、本专利技术通过对BlaR-CTD蛋白进行定点突变，得到能够同时识别40种β-内酰胺类抗生素，而现有的文献和专利报道尚不能识别如此多的对多种β-内酰胺类抗生素残留的检测。2、本专利技术建立的检测方法可以检测40种β-内酰胺类抗生素的残留，除头孢氨苄外其他药物的最低检测限均在欧盟规定的MRL以下，而且，当待检测β-内酰胺类抗生素种类为已知时，可以对其进行半定量分析。而现有微生物学方法做同类检测，其检测限为高，即现有方法识别的抗生素种类有限，并且无法定量。3、本专利技术适用的组织包括牛奶、猪、鸡、牛的肌肉组织，适用范围广。4、本专利技术涉及的样品处理方法简便，易操作，准确度和精密度好。附图说明序列表SEQIDNO:1是突变蛋白I188K-S19C-G24C的核苷酸序列。该序列表中，55位碱基由A替换为T，70位碱基由G替换为T，563、564位碱基由TT替换为AA。序列表SEQIDNO:2是突变蛋白I188K-S19C-G24C的蛋白质序列。该序列表中，19位氨基酸由S替换为C，24位氨基酸由G替换为C，188位氨基酸由I替换为K。序列表SEQIDNO:3是扩增突变质粒pET-28a(+)-BlaR-CTD-S19C的正向引物F1的序列。序列表SEQIDNO:4是扩增突变质粒pET-28a(+)-BlaR-CTD-S19C的反向引物R1的序列。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种识别β‑内酰胺类抗生素残留的突变蛋白，其特征在于：该突变蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种识别β-内酰胺类抗生素残留的突变蛋白，其特征在于：该突变蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种识别β-内酰胺类抗生素残留的突变蛋白，其特征在于：该突变蛋白的蛋白质序列如SEQIDNO:2所示。3.一种表达β-内酰胺类抗生素的突变蛋白BlaR-CTD的大肠杆菌，该大肠杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2018132。4.权利要求3所述的大肠杆菌，它是由质粒pET-28a(+)-BlaR-CTD-I188K-S19C-G24C转化大肠杆菌BL21感受态细胞所得。5.一种利用突变蛋白同时对40种β-内酰胺类类抗生素残留的检测方法，包括：构建突变蛋白，对突变蛋白进行诱导表达及纯化，建立β-内酰胺类抗生素检测方法和利用突变蛋白检测β-内酰胺类抗生素，其特征还包括如下步骤：(1)以原核表达载体pET-28a(+)-BlaR-CTD为模板，用突变引物(引物序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁宗辉，程古月，宁佳囡，王玉莲，彭大鹏，倪腾腾，黄玲利，戴梦红，陶燕飞，王旭，谢书宇，刘振利，谢长清，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42