LbCpf1-RR突变体用于CRISPR/Cpf1系统在植物基因编辑中的应用技术方案

本发明专利技术公开了LbCpf1‑RR突变体用于CRISPR/Cpf1系统在植物基因编辑中的应用。本发明专利技术以OsPDS基因和OsSBEIIb基因为靶基因，构建了靶向一个基因的双位点和两个基因的系列载体，并利用农杆菌转化方法将载体导入水稻愈伤中，利用LbCpf1‑RR突变体成功获得了目的基因敲除的水稻植株。LbCpf1‑RR突变体与蛋白质LbCpf1的唯一不同在于：第532位的氨基酸由G变为R，第595位的氨基酸由K变为R。本发明专利技术提供的LbCpf1‑RR突变体由于扩充了其识别的PAM位点序列，所以扩大了CRISPR/Cpf1系统在水稻基因组中的编辑范围，对于推进此系统在植物基因组编辑领域中的应用有重要意义。本发明专利技术具有重大的应用价值。

Application of LbCpf1-RR mutant to CRISPR/Cpf1 system in plant gene editing

The invention discloses the application of LbCpf1 RR mutant to CRISPR/Cpf1 system in plant gene editing. In the present invention, OsPDS gene and OsSBEIIb gene are used as target genes to construct a series of vectors targeting one gene with two loci and two genes, and the vectors are introduced into rice callus by Agrobacterium tumefaciens transformation method, and the rice plants with target gene knockout are successfully obtained by using LbCpf1_RR mutant. The only difference between LbCpf1_RR mutant and protein LbCpf1 is that the amino acids at position 532 change from G to R, and the amino acids at position 595 change from K to R. The LbCpf1_RR mutant provided by the invention enlarges the editing range of the CRISPR/Cpf1 system in rice genome because it expands the PAM locus sequence recognized by the mutant, which is of great significance for promoting the application of the system in the field of plant genome editing. The invention has great application value.

【技术实现步骤摘要】
LbCpf1-RR突变体用于CRISPR/Cpf1系统在植物基因编辑中的应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及LbCpf1-RR突变体用于CRISPR/Cpf1系统在植物基因编辑中的应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术已经成为分子生物学中最强大的工具之一，且被广泛应用于植物和农作物功能基因改良。CRISPR/Cas9系统首次在细菌中发现，由sgRNA和Cas9蛋白两部分组成(Jineketal.，2012)。Cas9蛋白通过自身的核酸内切酶活性，对任何紧随PAM(NGG)的20bp的靶点序列进行编辑，从而引起靶位点基因组DNA序列双链断裂(double-strandbreaks，DSBs)，然后通过非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)或同源重组介导的修复(homology-directedrepair，HDR)两种方式引入突变。目前，常用的Cas9蛋白为SpCas9及其各种突变体，识别的PAM序列分别为“NGG”、“NGA”或“NGCG”。CRISPR/Cpf1系统和CRISPR/Cas9系统同属Ⅱ类CRISPR系统，但前者仅需要一条更短的crRNA即可实现基因编辑，更有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。CRISPR/Cpf1系统一经建立便被应用于人类与动物细胞系及水稻、烟草、大豆、拟南芥等不同植物基因组的定点敲除和功能分析研究中，并且获得较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株(Endoetal.，2016；Huetal.，2016；Kimetal.，2017；Tangetal.，2017；Wangetal.，2017；Xuetal.，2017)。CRISPR/Cpf1系统由crRNA和Cpf1蛋白两部分组成，Cpf1蛋白对“TTTN”的PAM位点进行识别，在crRNA的引导下对基因组DNA的靶位点进行切割(Zetscheetal.，2015)。与CRISPR/Cas9系统相比，CRISPR/Cpf1系统有如下优势：Cpf1只需单个RNA，即crRNA(CRISPRRNA)，crRNA长度为43nt，且切割无需tracrRNA的帮助，因而组装更加简单；因其识别的PAM位点为“TTTN”，因此可识别富含AT的5’和3’UTR区域；一次可对多种靶位点进行编辑，实现简单的基因多重编辑，同时具有更高的编辑效率和较低的脱靶效应。但识别的PAM位点序列的限制，不利于CRISPR/Cpf1的更为广泛的应用。最近一项在人类细胞中的研究表明，通过对Cpf1蛋白进行突变，改变其识别的PAM位点序列，从而克服了PAM位点的限制(Gaoetal.,2017)，但是突变的Cpf1蛋白在植物中是否仍具有核酸酶活性，需要进一步研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何扩大CRISPR/Cpf1系统在植物基因组中的编辑范围。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种表达盒甲。所述表达盒甲中由启动子甲启动LbCpf1-RR突变体的编码基因表达。所述LbCpf1-RR突变体可为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列表中序列4自N端起第41至1267位所示的蛋白质；a2)在a1)所示蛋白质的N末端添加一个甲硫氨酸残基，得到的蛋白质；a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；a4)在a1)或a2)或a3)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。所述表达盒甲自5’端至3’端依次可包括如下原件：所述启动子甲、所述LbCpf1-RR突变体的编码基因和终止子。所述LbCpf1-RR突变体的编码基因可为b1)或b2)或b3)或b4)或b5)：b1)编码区为序列表中序列1自5'末端起第1137至4817位的反向互补序列所示的DNA分子；b2)核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端起第1137至4817位的反向互补序列所示的DNA分子；b3)核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端起第1089至4937位的反向互补序列所示的DNA分子；b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码LbCpf1-RR突变体的DNA分子；b5)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码LbCpf1-RR突变体的DNA分子。所述启动子甲具体可为Ubi启动子。所述Ubi启动子的核苷酸序列可为序列表序列1自5'末端起第4940至6925位的反向互补序列所示的DNA分子。所述终止子具体可为Nos终止子。所述Nos终止子的核苷酸序列可为序列表序列1自5'末端起第817至1069位的反向互补序列所示的DNA分子。所述表达盒甲中还可包括一个以上Flag标签和/或一个以上核定位信号。所述表达盒甲中具体可包括3个Flag标签(即3×Flag标签)、核定位信号甲和核定位信号乙。所述表达盒甲自5’端至3’端依次可包括如下原件：所述Ubi启动子、所述3×Flag标签、所述核定位信号乙、所述LbCpf1-RR突变体的编码基因、所述核定位信号甲和Nos终止子。所述3×Flag标签的核苷酸序列具体可如序列表序列1自5'末端第4869至4937位的反向互补序列所示的DNA分子。所述核定位信号乙的核苷酸序列具体可如序列表序列1自5'末端第4818至4868位的反向互补序列所示的DNA分子。所述核定位信号甲的核苷酸序列具体可如序列表序列1自5'末端1089至1136位的反向互补序列所示的DNA分子。所述表达盒甲的核苷酸序列具体可如序列表序列1自5'末端第817至6925位的反向互补序列所示。所述启动LbCpf1-RR突变体的编码基因表达具体可为启动LbCpf1-RR突变体的编码基因在植物中的表达。含有上述任一所述表达盒甲的重组质粒也属于本专利技术的保护范围。所述重组质粒还可包括表达盒乙；所述表达盒乙中可由启动子乙启动crRNA转录。所述表达盒乙自5’端至3’端依次可包括启动子乙和M个crRNA区段；每个crRNA区段自5’端至3’端依次包括核酸酶甲的核苷酸序列、crRNA的编码基因和核酸酶乙的核苷酸序列；每相邻两个crRNA区段之间具有N个脱氧核糖核苷酸组成的间隔序列；M为1以上且5以下的自然数；N为10以上且15以下的自然数。所述核酸酶甲具体可为Hammerhead(HH)型核酸酶。所述核酸酶乙具体可为丁型肝炎病毒(HDV)核酸酶。Hammerhead(HH)型核酸酶的核苷酸序列具体可如序列表序列1自5'末端第394至436位所示。丁型肝炎病毒(HDV)核酸酶的核苷酸序列具体可如序列表序列1自5'末端第481至548位所示。所述crRNA可与靶基因上的靶标片段特异结合。所述靶标片段可具有结构1：5’-TTTV-NX-3’或结构2：5’-TYCV-NX-3’，其中N为A、G、C或T，X为23，V为A、C或G，Y为C或T。所述表达盒乙自5’端至3’端具体可由启动子乙和2个crRNA区段组成。所述crRNA区段的核苷酸序列具体可如序列表中序列1、序列2或序列3自5’末端起第458至480位所示。所述crRNA区段的核苷酸序列具体可如序列表中序列1、序列2或序列3自5’末端起第623至645位所示。所述启动子乙具体可为OsU3启动子。所述OsU3启动子的核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达盒甲；所述表达盒甲中由启动子甲启动LbCpf1‑RR突变体的编码基因表达；所述LbCpf1‑RR突变体为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列表中序列4自N端起第41至1267位所示的蛋白质；a2)在a1)所示蛋白质的N末端添加一个甲硫氨酸残基，得到的蛋白质；a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；a4)在a1)或a2)或a3)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种表达盒甲；所述表达盒甲中由启动子甲启动LbCpf1-RR突变体的编码基因表达；所述LbCpf1-RR突变体为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列表中序列4自N端起第41至1267位所示的蛋白质；a2)在a1)所示蛋白质的N末端添加一个甲硫氨酸残基，得到的蛋白质；a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；a4)在a1)或a2)或a3)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。2.如权利要求1所述的表达盒甲，其特征在于：所述表达盒甲自5’端至3’端依次包括如下原件：所述启动子甲、所述LbCpf1-RR突变体的编码基因和终止子。3.如权利要求1或2所述的表达盒甲，其特征在于：所述LbCpf1-RR突变体的编码基因为b1)或b2)或b3)或b4)或b5)：b1)编码区为序列表中序列1自5'末端起第1137至4817位的反向互补序列所示的DNA分子；b2)核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端起第1137至4817位的反向互补序列所示的DNA分子；b3)核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端起第1089至4937位的反向互补序列所示的DNA分子；b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码LbCpf1-RR突变体的DNA分子；b5)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码LbCpf1-RR突变体的DNA分子。4.含有权利要求1至3任一所述表达盒甲的重组质粒。5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒还包括表达盒乙；所述表达盒乙中由启动子乙启动crRNA转录。6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于：所述表达盒乙自5’端至3’端依次包括启动子乙和M个crRNA区段；每个crR...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏兰琴，李少雅，赵云德，张欣，王文生，杜文明，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11