基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法技术

本发明专利技术提供一种基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法，根据待编辑的植物靶基因，分别构建基因编辑载体和基因同源重组载体，然后，用两种载体共同转化植物，获得转基因植株。其中，所述基因编辑载体至少包含Cas9表达框和gRNA表达元件，所述基因同源重组载体至少包含来源于菜豆黄矮病毒的复制子元件、同源左臂、待敲入基因和同源右臂。本发明专利技术将靶标供体片段和基因编辑元件分别构建在两个载体上，减少了复制子的负荷，有效增加了靶标同源片段的拷贝数，在有效地对染色体进行编辑的基础上，增加了靶标序列的拷贝数，将极大地提高同源重组的效率。

Efficient homologous recombination of plants based on CRISPR/Cas9

The invention provides a high efficient homologous recombination method for plants based on CRISSPR/Cas9. According to the target genes of plants to be edited, the gene editing vector and the gene homologous recombination vector are respectively constructed. Then, the transgenic plants are obtained by co-transformation of the two vectors. The gene editing vector contains at least a Cas9 expression frame and a gRNA expression element, and the gene homologous recombinant vector contains at least a replicon element, a homologous left arm, a knock-in gene and a homologous right arm derived from the bean yellow dwarf virus. The invention constructs the target donor fragment and the gene editing element on two carriers respectively, reduces the load of the replicator, effectively increases the copy number of the target homologous fragment, increases the copy number of the target sequence on the basis of effectively editing the chromosome, and greatly improves the efficiency of homologous recombination.

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法
本专利技术涉及基因编辑
，具体地说，涉及一种基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法。
技术介绍
菜豆黄矮病毒(BeYDV)最早从菜豆中分离，隶属于双生病毒科的玉米线条病毒属(Liuetal.,1997,Journal/JGenVirol,78(Pt8):2113-2117)，其可以侵染菜豆、鹰嘴豆、烟草、番茄、马铃薯、拟南芥等植物(Halley-Stottetal.,2007,Journal/ArchVirol,152:1237-1240；Liuetal.,1999,Journal/Virology,256:270-279；Liuetal.,1997,Journal/JGenVirol,78(Pt8):2113-2117)。利用其复制子元件，通过农杆菌介导侵染植物如烟草、番茄和生菜，可在植物细胞中产生高拷贝靶标DNA片段(Collensetal.,2007,Journal/BiotechnolProg,23:570-576；HefferonandDugdale,2003,Journal/JGenVirol,84:3465-3472；HefferonandFan,2004,Journal/Vaccine,23:404-410；Hefferonetal.,2004,Journal/JMolMicrobiolBiotechnol,7:109-114；Huangetal.,2009,Journal/BiotechnolBioeng,103:706-714；Moretal.,2003,Journal/BiotechnolBioeng,81:430-437；ZhangandMason,2006,Journal/BiotechnolBioeng,93:271-279)。CRISPR/Cas9是继锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)之后出现的第三代基因组定点编辑技术。与前两代技术相比，其具有成本低、制作简便、快捷高效的优点，可用于靶标基因的敲除或敲入、表观基因组编辑、定向控制转录水平及其他类型的基因工程(DoudnaandCharpentier,2014,Journal/Science,346:1258096)。DNA双链断裂(DSB)后，细胞内有两种机制来修复，即非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)，NHEJ易引起片段在断裂位点的缺失或插入(SymingtonandGautier,2011,Journal/AnnuRevGenet,45:247-271)。而同源重组是利用外源核酸片段来精确修复DNA，但与NHEJ相比，同源重组的效率极低(一般低于1％)。DNA同源重组的实现取决于两个关键因子，即DNA的有效切割及靶标同源片段的有效数量。因此，在核酸酶Cas9的作用下，靶标同源片段是否充足成为决定同源重组能否实现的关键。而植物双生病毒的Rep复制子可以借助植物的酶系统进行高效的复制靶标序列，这为植物细胞内同源修复提供了大量的同源重组模板。在番茄利用菜豆黄矮病毒(BeYDV)(Cermaketal.,2015,Journal/GenomeBiol,16:232)及在小麦(Gil-Humanesetal.,2017,Journal/PlantJ,89:1251-1262)和水稻中利用小麦矮缩病毒(WDV)(Wangetal.,2017,Journal/MolPlant,10:1007-1010)的DNA复制元件，在CRISPR/Cas9介导下实现了番茄、小麦和水稻的同源重组。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供基于CRISPR/Cas9技术开发的一种用于植物基因编辑的载体。本专利技术的另一目的是提供一种基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术基于CRISPR/Cas9技术开发的一种用于植物基因编辑的载体，包括基因编辑载体和基因同源重组载体；其中，所述基因编辑载体至少包含Cas9表达框和gRNA表达元件，所述基因同源重组载体至少包含来源于菜豆黄矮病毒的复制子元件、同源左臂、待敲入基因和同源右臂。所述基因同源重组载体中各元件之间的连接关系为：LIR-RepA-SIR-同源左臂-待敲入基因-同源右臂-LIR；其中，LIR为长基因间隔区，SIR为短基因间隔区，RepA为菜豆黄矮病毒的复制子。本专利技术还提供上述基因编辑载体和基因同源重组载体在植物基因编辑中的应用。本专利技术还提供一种基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法，根据待编辑的植物靶基因，分别构建基因编辑载体和基因同源重组载体，然后，用两种载体共同转化植物，获得转基因植株。其中，所述基因编辑载体至少包含Cas9表达框和gRNA表达元件，所述基因同源重组载体至少包含来源于菜豆黄矮病毒的复制子元件、同源左臂、待敲入基因和同源右臂。优选地，所述基因同源重组载体中各元件之间的连接关系为：LIR-RepA-SIR-同源左臂-待敲入基因-同源右臂-LIR。其中，LIR为长基因间隔区，SIR为短基因间隔区，RepA为菜豆黄矮病毒的复制子。其中，LIR-RepA-SIR和LIR的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1-2所示。更优选地，所述基因编辑载体和基因同源重组载体的骨架载体分别为pGreen0029和pKSE401。本专利技术还提供上述方法在植物基因编辑中的应用。所述植物包括但不限于油菜、小麦、拟南芥、烟草、玉米、棉花、水稻、番茄、大白菜、圆白菜、甘蓝、辣椒、胡萝卜、白萝卜、黄瓜、香蕉、棕榈、木瓜、苹果、梨、桃。本专利技术还提供上述方法在GUS基因编辑中的应用，包括以下步骤：1)pHR04a载体的构建：根据NCBI中公开的菜豆黄矮病毒序列(NO.DQ458791)合成其复制子元件LIR-RepA-SIR，构建到pGreen0029载体的SphI和StuI位点之间，得到中间载体I；然后用SphI酶切中间载体I，通过In-fusion克隆，将LIR片段构建到中间载体I上，即得载体pHR04a；2)pHR04a-AsRed载体的构建：将表达框CasMV35S-AsRed-Nos构建到载体pHR04a的AscI和BstXI位点之间，即得载体pHR04a-AsRed；其中，CasMV35S-AsRed-Nos的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；3)pHR03载体的构建：以pKSE401为骨架载体，将由CasMV35S启动子驱动的Cas9表达系统替换成YAO启动子驱动，得到载体pKSE401-YAO；然后将LIR片段构建到载体pKSE401-YAO的EcoRI位点，得到中间载体II；然后用PmeI酶切中间载体II，通过In-fusion克隆，将LIR-RepA-SIR片段构建到中间载体II上，即得载体pHR03；4)GUS基因编辑载体的构建：gRNA识别GUS基因上的核酸序列为5’-GACCGGATGCCGACGCGAAG-3’，据此设计两条单链DNA，分别为5’-attGGACCGGATGCCGACGCGAAG-3’和5’-aaacCTTCGCGTCGGCATCCGGTC-3’，将两条单链DNA进行杂交，所得双链DNA片段与BsaI酶切后的载体pKSE401-GFP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于CRISPR/Cas9技术开发的一种用于植物基因编辑的载体，其特征在于，包括基因编辑载体和基因同源重组载体；其中，所述基因编辑载体至少包含Cas9表达框和gRNA表达元件，所述基因同源重组载体至少包含来源于菜豆黄矮病毒的复制子元件、同源左臂、待敲入基因和同源右臂。

【技术特征摘要】
1.基于CRISPR/Cas9技术开发的一种用于植物基因编辑的载体，其特征在于，包括基因编辑载体和基因同源重组载体；其中，所述基因编辑载体至少包含Cas9表达框和gRNA表达元件，所述基因同源重组载体至少包含来源于菜豆黄矮病毒的复制子元件、同源左臂、待敲入基因和同源右臂。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述基因同源重组载体中各元件之间的连接关系为：LIR-RepA-SIR-同源左臂-待敲入基因-同源右臂-LIR；其中，LIR为长基因间隔区，SIR为短基因间隔区，RepA为菜豆黄矮病毒的复制子。3.基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法，其特征在于，根据待编辑的植物靶基因，分别构建基因编辑载体和基因同源重组载体，然后，用两种载体共同转化植物，获得转基因植株；其中，所述基因编辑载体至少包含Cas9表达框和gRNA表达元件，所述基因同源重组载体至少包含来源于菜豆黄矮病毒的复制子元件、同源左臂、待敲入基因和同源右臂。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因同源重组载体中各元件之间的连接关系为：LIR-RepA-SIR-同源左臂-待敲入基因-同源右臂-LIR；其中，LIR为长基因间隔区，SIR为短基因间隔区，RepA为菜豆黄矮病毒的复制子。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述基因编辑载体和基因同源重组载体的骨架载体分别为pGreen0029和pKSE401。6.权利要求3-5任一项所述方法在植物基因编辑中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物选自油菜、小麦、拟南芥、烟草、玉米、棉花、水稻、番茄、大白菜、圆白菜、甘蓝、辣椒、胡萝卜、白萝卜、黄瓜、香蕉、棕榈、木瓜、苹果、梨、桃。8.权利要求3-5任一项所述方法在GUS基因编辑中的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)pHR04a载体的构建：根据NCBI中公开的菜豆黄矮病毒序列合成其复制子元件LIR-RepA-SIR，构建到pGreen0029载体的SphI和StuI位点之间，得到中间载体I；然后用SphI酶切中间载体I，通过In-fusion克隆，将LIR片段构建到中间载体I上，即得载体pHR04a；2)pHR04a-AsRed载体的构建：将表达框CasMV35S-AsRed-Nos构建到载体pHR04a的AscI和BstXI位点之间，即得载体pHR04a-AsRed；3)pHR03载体的构建：以pKSE401为骨架载体，将由CasMV35S启动子驱动的Cas9表达系统替换成YAO启动子驱动，得到载体pKSE401-YAO；然后将LIR片段构建到载体pKSE401-YAO的EcoRI位点，得到中间载体II；然后用PmeI酶切中间载体II，通过In-fusion克隆，将LIR-RepA-SIR片段构建到中间载体II上，即得载体pHR03；4)GUS基因编辑载体的构建：gRNA识别GUS基因上的核酸序列为5’-GACCGGATGCCGACGCGAAG-3’，据此设计两条单链DNA，分别为5’-attGGACCGGATGCCGACGCGAAG-3’和5’-aaacCTTCGCGTCGGCATCCGGTC-3’，将两条单链DNA进行杂交，所得双链DNA片段与BsaI酶切后的载体pKSE401-GFP-YAO连接，即得GUS基因编辑载体；其中，所述载体pKSE401-GFP-YAO是以pKSE401-YAO为骨架，在Spe...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡赞民，范成明，李冬冬，王晓波，陈宇红，袁静，韩方普，张彦峰，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11