一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法技术

本发明专利技术公开了一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法。该方法包括：采用含有目的基因表达载体的发根农杆菌的侵染液侵染灯盏细辛无菌叶盘，然后置于MS固体培养基上25±2℃暗培养2天；然后转至筛选培养基上，于25℃暗培养，每隔15～20天继代一次，直至获得灯盏细辛毛状根；进行鉴定。本发明专利技术首次以绿色荧光蛋白(GFP)作为目的基因，为进一步利用绿色荧光蛋白基因作为构建药用成分生物合成途径的报告基因提供一定的参考依据，实现了该基因在灯盏细辛毛状根遗传转化体系的高效表达，同时对外源基因在灯盏细辛毛状根生物反应器中的高效表达的可行性研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法
本专利技术属于植物基因工程
，涉及一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法。
技术介绍
灯盏细辛又名灯盏花，为菊科植物短葶飞蓬(Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.)的干燥全草。主要分布于云南、四川、贵州、广西等地。具有活血化瘀、通络止痛，祛风散寒等功效。我国对灯盏细辛化学成分的研究始于20世纪70年代中期，目前已分离鉴定出黄酮类、咖啡酰类、酚酸类、吡喃酮类、植物甾醇、倍半萜类等多种类型的化学成分，其中以灯盏甲素和灯盏乙素为代表的黄酮类化合物是其活性成分。其注射液制剂在临床上主要用于治疗心脑血管系统疾病，除此之外，对治疗老年性疾病、颈性眩晕、糖尿病、肾病等疾病也具有很好的效果。绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)是1962年由ShimomuraO等首次从多管水母属(Aequoreavictoria)中分离纯化出的一种具有独特功能的生物发光蛋白。能够通过催化自身65～67位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化形成稳定的生色团，在蓝光或紫外光激发下产生的绿色荧光，GFP作为一种标记蛋白具有发光稳定、耐受性良好、检测方便、可进行活体观察、对受体细胞基本无毒和损伤作用等优点，已成为监测外源基因在遗传转化体系中表达情况的有效工具。目前，针对灯盏细辛的相关研究主要集中在有效成分的提取分离、药效和药理等方面，偶见灯盏细辛遗传转化体系研究的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法，为进一步提升灯盏细辛药用成分含量以及探究在灯盏细辛毛状根遗传转化体系中外源基因的高效表达奠定基础。第一方面，本专利技术要求保护一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法。本专利技术所提供的灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法，具体可包括如下步骤：(a1)采用含有目的基因表达载体的发根农杆菌的侵染液侵染灯盏细辛无菌叶盘，将侵染后的灯盏细辛叶盘置于MS固体培养基上，于25±2℃(如25℃)恒温暗培养2天。其中，所述侵染液为用重悬液重悬所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌至OD600值为0.6所得；所述重悬液为含有终浓度为100μmol·L-1乙酰丁香酮的MS液体培养基。所述MS固体培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：大量元素：NH4NO31650mg·L-1、KNO31900mg·L-1、CaCl2·2H2O440mg·L-1、MgSO4·7H2O370mg·L-1、KH2PO4170mg·L-1；微量元素：KI0.83mg·L-1、H3BO36.2mg·L-1、MnSO4·4H2O22.3mg·L-1、ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1、CuSO4·5H2O0.025mg·L-1、CoCl2·6H2O0.025mg·L-1；铁盐：FeSO4·7H2O27.8mg·L-1、Na2-EDTA·2H2O37.3mg·L-1；有机物质：肌醇100mg·L-1、烟酸0.5mg·L-1、盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg·L-1、盐酸硫胺素(维生素B1)0.1mg·L-1、甘氨酸2.0mg·L-1；蔗糖30g·L-1；琼脂8g·L-1；pH：5.8-6.0。注：以上各物质的浓度均为在MS固体培养基中的终浓度。在本专利技术的一个实施例中，所述MS固体培养基是采用MS培养基粉末(即所述大量元素、所述微量元素、所述铁盐和所述有机物质)、蔗糖和琼脂配制而成，其中所述MS粉末为PhytoTechnologyLaboratories公司产品，货号：M519，商品名称：Murashige&SkoogBasalMediumwithVitamins，规格：100L，使用浓度：4.43g/L；蔗糖：30g/L；琼脂：8g/L；pH:5.8-6.0。以上各物质的浓度均为在MS固体培养基中的终浓度。所述MS液体培养基与所述MS固体培养基相比，差别仅在于不含有琼脂。(a2)将步骤(a1)培养后的灯盏细辛叶盘转至筛选培养基上，于25℃暗培养，每隔15～20天继代一次，共进行两次以上继代(如三次)，直至获得灯盏细辛毛状根。其中，进行所述继代时采用的培养基与所述筛选培养基均为含有抗生素的1/2MS固体培养基；所述抗生素为抗生素1和抗生素2，所述抗生素1为所述目的基因表达载体上携带的抗性筛选标记所对应的抗生素，所述抗生素2为能够抑制所述发根农杆菌生长的抗生素。所述继代培养基中的所述抗生素2的含量少于所述筛选培养基中所述抗生素2的含量，且进行后一次继代时采用的所述继代培养基中的所述抗生素2的含量均少于进行前一次继代时采用的所述继代培养基中的所述抗生素2的含量。另外，进行最后一次继代时采用的所述继代培养基中的所述抗生素2的含量具体可为0。所述继代培养基与所述筛选培养基中的所述抗生素1的含量可相同，也可不相同。(a3)对步骤(a2)所得灯盏细辛毛状根进行鉴定。进一步地，步骤(a1)中，采用所述侵染液侵染灯盏细辛无菌叶盘前，不包括将所述灯盏细辛无菌叶盘进行预培养的步骤。进一步地，步骤(a1)中，所述侵染液可按照包括如下步骤的方法制备得到：向OD600值为0.4的所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌的培养液中加入终浓度为100μmol·L-1的乙酰丁香酮，继续培养至菌液OD600值为0.6，离心(如室温条件下，4000×g离心7min)后弃上清液，用所述重悬液重悬所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌，即得所述侵染液。进一步地，步骤(a1)中，所述灯盏细辛无菌叶盘可为0.4～0.6cm2大小的叶盘。进一步地，步骤(a1)中，采用所述侵染液侵染所述灯盏细辛无菌叶盘可按照包括如下步骤的方法进行：将所述灯盏细辛无菌叶盘置于所述侵染液中，28℃100r·min-1振荡10min后捞出，无菌纸吸干叶盘表面残留菌液。进一步地，步骤(a1)中，所述发根农杆菌具体可为农杆菌C58C1。进一步地，步骤(a2)中，所述抗生素2具体可为头孢噻污钠(Cef)。所述抗生素1具体可为潮霉素B(Hyg)。更进一步地，所述筛选培养基是在1/2MS固体培养基中加入头孢噻污钠、潮霉素B后得到的培养基；所述筛选培养基中头孢噻污钠的终浓度为500mg·mL-1、潮霉素B的终浓度为2.5mg·mL-1。其中，所述1/2MS固体培养基与所述MS固体培养基相比，差别仅在于其中所述大量元素、所述微量元素、所述铁盐和所述有机物质的含量减半。步骤(a2)中共进行了三次继代。进行第一次继代时，所采用的所述继代培养基是在1/2MS固体培养基中加入头孢噻污钠、潮霉素B后得到的培养基；所述继代培养基中头孢噻污钠的终浓度为300mg·mL-1、潮霉素B的终浓度为2.5mg·mL-1。进行第二次继代时，所采用的所述继代培养基是在1/2MS固体培养基中加入头孢噻污钠、潮霉素B后得到的培养基；所述继代培养基中头孢噻污钠的终浓度为100mg·mL-1、潮霉素B的终浓度为2.5mg·mL-1。进行第三次继代时，所采用的所述继代培养基是在1/2MS固体培养基中加入潮霉素B后得到的培养基；所述继代培养基中潮霉素B的终浓度为2.5mg·mL-1。在本专利技术的一个实施例中，所述目的基因具体为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的编码基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法，包括如下步骤：(a1)采用含有目的基因表达载体的发根农杆菌的侵染液侵染灯盏细辛无菌叶盘，将侵染后的灯盏细辛叶盘置于MS固体培养基上，于25±2℃恒温暗培养2天；所述侵染液为用重悬液重悬所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌所得；所述重悬液为含有终浓度为100μmol·L‑1乙酰丁香酮的MS液体培养基；(a2)将步骤(a1)培养后的灯盏细辛叶盘转至筛选培养基上，于25℃暗培养，每隔15～20天继代一次，共进行两次以上继代，直至获得灯盏细辛毛状根；进行所述继代时采用的继代培养基与所述筛选培养基均为含有抗生素的1/2MS固体培养基；所述抗生素为抗生素1和抗生素2，所述抗生素1为所述目的基因表达载体上携带的抗性筛选标记所对应的抗生素，所述抗生素2为能够抑制所述发根农杆菌生长的抗生素；所述继代培养基中的所述抗生素2的含量少于所述筛选培养基中所述抗生素2的含量，且进行后一次继代时采用的所述继代培养基中的所述抗生素2的含量均少于进行前一次继代时采用的所述继代培养基中的所述抗生素2的含量；(a3)对步骤(a2)所得灯盏细辛毛状根进行鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法，包括如下步骤：(a1)采用含有目的基因表达载体的发根农杆菌的侵染液侵染灯盏细辛无菌叶盘，将侵染后的灯盏细辛叶盘置于MS固体培养基上，于25±2℃恒温暗培养2天；所述侵染液为用重悬液重悬所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌所得；所述重悬液为含有终浓度为100μmol·L-1乙酰丁香酮的MS液体培养基；(a2)将步骤(a1)培养后的灯盏细辛叶盘转至筛选培养基上，于25℃暗培养，每隔15～20天继代一次，共进行两次以上继代，直至获得灯盏细辛毛状根；进行所述继代时采用的继代培养基与所述筛选培养基均为含有抗生素的1/2MS固体培养基；所述抗生素为抗生素1和抗生素2，所述抗生素1为所述目的基因表达载体上携带的抗性筛选标记所对应的抗生素，所述抗生素2为能够抑制所述发根农杆菌生长的抗生素；所述继代培养基中的所述抗生素2的含量少于所述筛选培养基中所述抗生素2的含量，且进行后一次继代时采用的所述继代培养基中的所述抗生素2的含量均少于进行前一次继代时采用的所述继代培养基中的所述抗生素2的含量；(a3)对步骤(a2)所得灯盏细辛毛状根进行鉴定。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，采用所述侵染液侵染灯盏细辛无菌叶盘前，不包括将所述灯盏细辛无菌叶盘进行预培养的步骤。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，所述侵染液是按照包括如下步骤的方法制备得到的：向OD600值为0.4的所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌的培养液中加入终浓度为100μmol·L-1的乙酰丁香酮，继续培养至菌液OD600值为0.6，离心后弃上清液，用所述重悬液重悬所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌，即得所述侵染液。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，所述灯盏细辛无菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，郭娟，赵瑜君，于一凡，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11