转基因水稻GRH和黑金米的培育及GRH目的基因的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种转基因水稻GRH和黑金米的培育及GRH目的基因的检测方法，属于水稻育种领域。GRH的培育方法，包括：1)构建最终表达载体；2)最终表达载体的遗传转化，获得T0代转化植株；3)筛选T0代转化植株中目的基因均表现阳性的植株，自交结实，获得T1代转化植株；4)筛选T1代转化植株中无hpt表达的植株，命名为GRH。以GRH和黑米为亲本培育得到的黑金米富含花青素、叶黄素和β‑类胡萝卜素，具有一定的护眼保健功效。本发明专利技术提供的方法简单可靠，转化率高，目的基因插入不会造成水稻内源基因表达失活，具有良好的商业化潜力。

【技术实现步骤摘要】
转基因水稻GRH和黑金米的培育及GRH目的基因的检测方法
本专利技术属于水稻育种领域，具体涉及一种转基因水稻GRH和黑金米的培育及GRH目的基因的检测方法。
技术介绍
一些植物的次生代谢物对人体健康具有重要保健作用。比如花青素具有强抗氧能力，能够保护人体免受自由基的损伤。研究表明花青素可以预防某些慢性疾病比如糖尿病、肥胖、某些癌症以及心血管疾病(Zhangetal.2014)。β-胡萝卜素是植物来源的一种重要的维生素A原，可在人体内转换成维生素A。维生素A缺乏会导致夜盲症、干眼症，严重缺乏时会导致失明和致死(Schaubetal.2017)。叶黄素可以保护视网膜中的黄斑，预防老年性黄斑变性所导致的盲眼病(Madaanetal.2017)。此外，叶黄素还可以过滤进入眼睛中的有害蓝光，减少显示屏对眼睛的伤害，并降低白内障的发病率等。水稻是世界一半以上人口的主食，是我国最重要的粮食作物。水稻营养品质的微小改变，对于以水稻为主食的人口来说，由于长期食用的积累作用，其对于健康的促进作用也是巨大。我们一般食用的稻米为白色，基本不含有花青素、β-胡萝卜素和叶黄素。此外，市面上还有有很多以叶黄素、β-胡萝卜素以及天然抗氧化剂(花青素或原花青素)为有效成分的保健品很多，包括各种国产或进口的产品，可谓玲琅满目。而此类产品的主要功效就是保护视力，缓解视疲劳。但是普遍售价较高，一瓶价格几十元到几百元不等；此外，大多数中国人并不习惯于食用保健品，保健品的胶囊形式容易让人产生服用药物的感觉。对于身体基本健康的人群，往往难以坚持。中国人受中医思想的影响，崇尚“食药同源”。目前尚没有关于护眼保健大米的培育方法的相关报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种转基因水稻GRH和黑金米的培育方法，所述黑金米富含花青素、叶黄素和β-胡萝卜素，具有一定的护眼保健功效。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种转基因水稻品种GRH的培育方法，包括以下步骤：1)将目的基因转入含双T-DNA区的表达载体中，获得最终表达载体，所述双T-DNA区包括第一T-DNA区和第二T-DNA区，所述第一T-DNA区连接有hpt标记基因，所述第二T-DNA区连接目的基因；所述目的基因为八氢番茄红素合酶基因psy和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI；2)利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述最终表达载体转化入粳稻品种空育131中，获得T0代转化植株；3)利用PCR筛选所述T0代转化植株中psy、crtI和hpt均表现阳性的植株，进行自交结实，获得T1代转化植株；4)筛选所述T1代转化植株中无hpt表达的植株，得到转基因粳稻品种，命名为GRH。优选的，步骤1)所述八氢番茄红素合酶基因psy的5’端修饰有谷蛋白启动子和HindIII酶切位点，3’端修饰有nos终止子和SalI酶切位点，修饰后的八氢番茄红素合酶基因psy的核苷酸序列如SEQIDNO:17所示。优选的，步骤1)所述八氢番茄红素脱氢酶基因crtI的5’端修饰有谷蛋白启动子和EcoRI酶切位点，3’端修饰有nos终止子和KpnI酶切位点，修饰后的八氢番茄红素脱氢酶基因crtI的核苷酸序列如SEQIDNO:18所示。优选的，步骤1)所述含双T-DNA区的表达载体是在表达载体pCAMBIA1300的基础上改造获得的。优选的，步骤1)所述含双T-DNA区的表达载体的构建方法包括以下步骤：a)利用BstXI和XhoI双酶切表达载体pCAMBIA1300，去除CaMV35S启动子和hpt基因的编码区区段，得到包含第二T-DNA区的中间载体pMF；b)利用SacI和HindIII双酶切表达载体pCAMBIA1300，去除多克隆位点区段，得到中间载体pC1300E；c)向步骤b)得到的所述中间载体pC1300E在SphI酶切位点靠近EcoRI一侧引入SacII酶切位点，构建中间载体pC1300ES；d)去除步骤c)得到的所述中间载体pC1300ES的EcoRI酶切位点，得到中间载体pC1300NES；e)用SacII酶切步骤d)得到的所述中间载体pC1300NES，得到携带hpt的第一T-DNA区片段；f)将步骤a)得到的所述包含第二T-DNA区的中间载体pMF与步骤e)得到的所述携带hpt的第一T-DNA区片段连接，得到含双T-DNA区的表达载体；所述步骤a)分别与步骤b)、c)、d)和e)之间没有时间先后顺序的限制。优选的，步骤3)所述PCR筛选用的引物序列如SEQIDNO:1～6所示。本专利技术还提供了一种利用所述培育方法培育得到的GRH为亲本培育黑金米的方法，包括以下步骤：1)PCR筛选所述GRH的后植株中psy和crtI显性纯合的植株与黑米杂交，得到F1代；2)以所述黑米为轮回亲本与F1代进行回交，得到BC3F1代；3)将所述BC3F1代自交挑选psy和crtI显性纯合的后代植株后得到黑金米。优选的，步骤1)所述的筛选的引物序列如SEQIDNO:3～4及SEQIDNO:5～6所示。优选的，步骤1)所述的黑米品种为黑帅。优选的，步骤2)所述的BC3F1代的种子具有黑色的种皮和黄色的胚乳。本专利技术提供了一种黑金米的培育方法，所述培养方法得到的黑金米是转基因品种GRH与黑米的杂交育成的品种，同时富含花青素，叶黄素和β-胡萝卜素，营养价值分别显著高于两个亲本；采用大米表达护眼保健成分，可以在进食的同时达到保健的效果；且该培育方法简单，效率高且培育周期短。附图说明图1为含双T-DNA区的pCAMBIA1300的物理图谱(a)和最终表达载体pC1300dT-psy/crtI的T-DNA区结构示意图(b)；图2为GRH的分子检测和表型观察图；其中(a)T1代转基因植株群体中检测hpt标记基因的PCR结果图；(b)为GRH的Southern分析图，总DNA用HindIII酶切，Southern分析所用探针为crtI基因的PCR扩增片段，泳道T为转基因材料GRH，泳道M为DNAMarker，泳道W为野生型空育131；(c)为去壳的空育131和GRH的种子；图3为黑金米的培育流程图，其中(a)为黑金米的育种流程；(b)为黑金米与其亲本GRH和黑帅的表型对比；图4为GRH和黑金米外源基因的插入位置；图5为黑金米特征性PCR检测结果图；图6为中间载体PMF结构示意图；图7为中间载体pC1300E结构示意图。具体实施方式本专利技术提供了一种转基因水稻品种GRH的培育方法，包括以下步骤：1)将目的基因转入含双T-DNA区的表达载体中，获得最终表达载体，所述双T-DNA区包括第一T-DNA区和第二T-DNA区，所述第一T-DNA区连接有hpt标记基因，所述第二T-DNA区连接目的基因；所述目的基因为八氢番茄红素合酶基因psy和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI；2)利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述最终表达载体转化入粳稻品种空育131中，获得T0代转化植株；3)利用PCR筛选所述T0代转化植株中psy、crtI和hpt均表现阳性的植株，进行自交结实，获得T1代转化植株；4)筛选所述T1代转化植株中无hpt表达的植株，得到转基因粳稻品种，命名为GRH。本专利技术中，将目的基因转入含双T-DNA区的表达载体中，获得最终表达载体，第一T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因水稻品种GRH的培育方法，包括以下步骤：1)将目的基因转入含双T‑DNA区的表达载体中，获得最终表达载体，所述双T‑DNA区包括第一T‑DNA区和第二T‑DNA区，所述第一T‑DNA区连接有hpt标记基因，所述第二T‑DNA区连接目的基因；所述目的基因为八氢番茄红素合酶基因psy和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI；2)利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述最终表达载体转化入粳稻品种空育131中，获得T0代转化植株；3)利用PCR筛选所述T0代转化植株中psy、crtI和hpt均表现阳性的植株，进行自交结实，获得T1代转化植株；4)筛选所述T1代转化植株中无hpt表达的植株，得到转基因粳稻品种，命名为GRH。

【技术特征摘要】
1.一种转基因水稻品种GRH的培育方法，包括以下步骤：1)将目的基因转入含双T-DNA区的表达载体中，获得最终表达载体，所述双T-DNA区包括第一T-DNA区和第二T-DNA区，所述第一T-DNA区连接有hpt标记基因，所述第二T-DNA区连接目的基因；所述目的基因为八氢番茄红素合酶基因psy和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI；2)利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述最终表达载体转化入粳稻品种空育131中，获得T0代转化植株；3)利用PCR筛选所述T0代转化植株中psy、crtI和hpt均表现阳性的植株，进行自交结实，获得T1代转化植株；4)筛选所述T1代转化植株中无hpt表达的植株，得到转基因粳稻品种，命名为GRH。2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，步骤1)所述八氢番茄红素合酶基因psy的5’端修饰有谷蛋白启动子和HindIII酶切位点，3’端修饰有nos终止子和SalI酶切位点，修饰后的八氢番茄红素合酶基因psy的核苷酸序列如SEQIDNO:17所示。3.根据权利要求1或2所述的培育方法，其特征在于，步骤1)所述八氢番茄红素脱氢酶基因crtI的5’端修饰有谷蛋白启动子和EcoRI酶切位点，3’端修饰有nos终止子和KpnI酶切位点，修饰后的八氢番茄红素脱氢酶基因crtI的核苷酸序列如SEQIDNO:18所示。4.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，步骤1)所述含双T-DNA区的表达载体是在表达载体pCAMBIA1300的基础上改造获得的。5.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，步骤1)所述含双T-DNA区的表达载体的构建方法包括以下步骤：a)利用BstXI和XhoI双酶切表达载体pCAMBIA1300，去除CaMV35S启动子和hpt基因的编码区区段，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈浩，林拥军，
申请(专利权)人：武汉天问生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42