一种外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法，该方法包括以下步骤：取刚好完全展开的桉树成熟叶片，消毒，损伤其表层表皮细胞，并取样得到叶盘；得到的叶盘置于外源基因重组农杆菌菌液中浸泡，抽真空；取出农杆菌侵染后的叶盘置于吸满MS液体培养基的无菌载体上，暗处放置培养至待农杆菌完成转化。取出农杆菌侵染后的叶盘置于吸满培养液的无菌滤纸上，暗处放置培养待农杆菌完成转化。通过本发明专利技术的叶盘瞬时表达法可快速检测启动子在桉树叶组织的转录活性，为启动子的改良和转录活性的快速检测提供了方法；还可初步确定目的基因表达变化及对其他基因表达和信号转导途径的影响，加快桉树的基因互作和信号转导的研究进程，避开桉树转化困难和难获得转基因苗的窘况。

Transient expression of exogenous gene into Eucalyptus

The invention discloses a method for instantaneous expression of exogenous gene into eucalyptus. The method comprises the following steps: taking mature leaves of Eucalyptus which are just fully unfolded, disinfecting, damaging the epidermal cells of the surface layer, and sampling leaf discs, and soaking the leaf discs in the solution of exogenous gene recombinant Agrobacterium tumefaciens, and vacuuminating; The leaves infected by Agrobacterium tumefaciens were placed on a sterile carrier filled with MS liquid medium and cultured in the dark until the transformation was completed. Leaf discs infected by Agrobacterium tumefaciens were placed on aseptic filter paper filled with culture medium and cultured in dark place until the transformation of Agrobacterium tumefaciens was completed. The leaf disc instantaneous expression method of the invention can quickly detect the transcriptional activity of promoter in Eucalyptus Leaf tissue, provide a method for improving promoter and rapid detection of transcriptional activity, and preliminarily determine the changes of target gene expression and its influence on other gene expression and signal transduction pathways, thus speeding up gene interaction and interaction in eucalyptus. The research process of signal transduction avoids the difficulty of transformation of Eucalyptus and the difficulty of obtaining transgenic seedlings.

【技术实现步骤摘要】
一种外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法
本专利技术涉及基因的瞬时表达
，更具体地，涉及一种外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法。
技术介绍
桉树原产澳大利亚，是桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)植物的统称，有900多个种、亚种和变种。由于桉树具有耐干旱、耐瘦瘠、适应性广、生长速度快、轮伐期短、用途广泛、经济效益高等诸多优点，被公认为三大人工林树种之一(杨民胜等，2011)。桉树是我国南方主要造林树种之一，全国桉树人工林面积已达368万hm2，且每年新营造桉树林达10万hm2(谢耀坚，2011)。近年来，在国家政策的大力支持下，南方以桉树为主的速生丰产林得到了快速发展，全国桉树人工林面积达450万hm2，丰富了我国的森林资源，缓解了木材供需矛盾，壮大了林业经济，桉树产业链年产值超3000亿元。罗基同等(2012)调查了速生丰产桉树病害，鉴定出30种传染性病害，其中15种为主要病害，严重的有枯梢病、树干溃疡病、轮纹叶斑病、花斑病、焦枯病、紫斑病、灰霉病和青枯病等8种真菌病害或细菌性病害。为了促进桉树产业的可持续发展，桉树生产必需解决好提高木材蓄积量、改良材质、增强病虫害抗性等诸多问题。由于桉树生长周期长，杂合度高，许多性状属于多基因控制的数量性状，人工杂交授粉难以控制，常规育种难度大、效率低，难以满足培育优良种质的要求。与传统育种方法相比，转基因技术可以打破传统育种中种间不亲和现象，消除杂交障碍，极大地拓宽优良基因的来源和应用，具有投入少、见效快等优点（Klocko等,2016）。通过转基因育种加速桉树的遗传改良，提高桉树生产力、木材质量和抗性，扩展桉树的种植范围，能为纤维材料、木材、能源等提供优质原材料，促进经济、生态、社会和环境的和谐发展。植物瞬时表达系统在启动子分析、基因功能分析和生产重组蛋白方面用途广泛。并且具有如下优点：①简单快速。转化基因可在转化的一周内进行分析，避免了组织培养等繁杂过程；②表达水平高。当单链的T-DNA进入植物细胞后，许多未整合到植物基因组中的游离外源基因同样可以表达。③安全有效。不受植物生长发育过程的影响，不产生可遗传的后代，结果可靠直观，不存在基因漂移的风险。另外，植物基因工程必须解决好怎样控制目的基因表达和控制什么基因表达的问题。怎样控制目的基因表达实质上是指如何选用启动子。启动子实质上是RNA聚合酶特异性识别后并结合的一段DNA序列，是调控基因转录的关键因子，也是构建基因工程表达载体的重要元件。启动子有组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子等。启动子在不同物种中的转录活性不一定相同，在其他作物中理想的启动子在桉树中转录活性如何需要检验。但桉树为木本植物，细胞中酚类物质含量高、组织培养时外植体极易褐变致死（Huang等，2010）。尤其是转化后的愈伤组织比单纯的再生过程中愈伤组织更易褐变致死，或者愈伤分化时容易出现嵌合体，造成桉树转化率低，遗传改良难度大。瞬时表达法检测基因表达已有研究报道，但多为烟草、拟南芥等模式植物。桉树组织培养过程容易褐变坏死、基因转化困难、难获得转基因苗。目前，尚没有一种高效的外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法。要大规模筛查优良启动子或者初步确定目的基因表达变化对其他基因表达和信号转导途径的影响非常困难。另一方面。通过转基因来鉴定启动子在桉树组织中的活性或者初步确定目的基因表达变化对其他基因表达和信号转导途径的影响费时费力，难度大，耗时长。找到桉树叶组织瞬时表达法的方法显得非常必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种利用农杆菌的桉树叶盘基因瞬时表达的方法。本专利技术的第一个目的是提供一种外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法。本专利技术的第二个目的是所述方法在进行启动子分析、基因功能分析或生产重组蛋白方面中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种利用权利要求1所述的方法的启动子分析方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法，该方法包括以下步骤：S1.取刚好完全展开的桉树成熟叶片，消毒，损伤其表层表皮细胞，并取样得到叶盘；S2.得到的叶盘置于外源基因重组农杆菌菌液中浸泡，抽真空；S3.取出农杆菌侵染后的叶盘置于吸满MS液体培养基的无菌载体上，暗处放置培养至待农杆菌完成转化。优选地，所述桉树为尾叶桉。优选地，步骤S2中，所述农杆菌为农杆菌GV3101。优选地，步骤S2中，所述农杆菌菌液为OD600为0.6~1.0。更优选地，步骤S2中，所述农杆菌菌液为OD600为0.7。优选地，步骤S1中，消毒的步骤为70%乙醇消毒30~45秒。优选地，步骤S1中，通过用砂纸摩擦损伤桉树成熟叶片表层表皮细胞。优选地，步骤S1中，使用圆形打孔器取样获得叶盘。优选地，步骤S1中，叶盘直径为0.8～1.2cm。更优选地，步骤S1中，叶盘直径为1cm。优选地，步骤S1中，所述桉树成熟叶片为1年龄尾叶桉树苗枝条第三节间刚好完全展开的成熟叶片。优选地，步骤S2中，抽真空的时间为10～20min。更优选地，步骤S2中，抽真空的时间为15min。优选地，步骤S2中，抽真空的压强为-0.1～-0.2兆帕。更优选地，步骤S2中，抽真空的压强为-0.2兆帕。优选地，步骤S3中，暗处放置培养10～12h。更优选地，步骤S3中，暗处放置培养12h。优选地，步骤S3中，所述无菌载体为无菌滤纸。最优选的，一种外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法，该方法包括以下步骤：S1.取刚好完全展开的1年龄尾叶桉树苗枝条第三节间刚好完全展开的成熟叶片，70%乙醇消毒30~45秒，损伤其表层表皮细胞，圆形打孔器取样，直径1cm；S2.得到的叶盘置于OD600为0.7的农杆菌GV3101菌液浸泡，抽真空，-0.2兆帕15min；S3.取出农杆菌侵染后的叶盘置于吸满MS液体培养基的无菌滤纸上，暗处放置12h，培养至待农杆菌完成转化。所述方法在进行启动子活性分析、基因功能分析或生产重组蛋白方面中的应用，也属于本专利技术的保护范围。一种利用以上所述的外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法的启动子活性分析方法，包括以下步骤：S1.将待检测的启动子连接于表达载体中报告基因上游；S2.按照权利要求1所述的方法进行瞬时表达；S3.用诱导因子处理农杆菌完成转化的叶盘；S4.检测报告基因的活性。优选地，所述报告基因为gus，gfp，rfp更优选地，所述报告基因为gus。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：通过本专利技术的叶盘瞬时表达法可用来快速检测启动子在桉树叶组织的转录活性，可为启动子的改良和转录活性的快速检测提供方法；还可初步确定目的基因表达变化对其他基因表达和信号转导途径的影响，可加快桉树的基因互作和信号转导的研究进程，避开桉树转化困难和难获得转基因苗的窘况。附图说明图1为叶盘瞬时表达法检测启动子GWSF在尾叶桉叶片的诱导表达活性；a：非转化；b：CaMV35S:gus的组成型表达；c：本底表达；d：青枯菌诱导；e：疫霉菌孢子诱导；f：水杨酸诱导；g：乙烯诱导。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：S1. 取刚好完全展开的桉树成熟叶片，消毒，损伤其表层表皮细胞，并取样得到叶盘；S2. 得到的叶盘置于外源基因重组农杆菌菌液中浸泡，抽真空；S3. 取出农杆菌侵染后的叶盘置于吸满MS液体培养基的无菌载体上，暗处放置培养至待农杆菌完成转化。

【技术特征摘要】
1.一种外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：S1.取刚好完全展开的桉树成熟叶片，消毒，损伤其表层表皮细胞，并取样得到叶盘；S2.得到的叶盘置于外源基因重组农杆菌菌液中浸泡，抽真空；S3.取出农杆菌侵染后的叶盘置于吸满MS液体培养基的无菌载体上，暗处放置培养至待农杆菌完成转化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述桉树为尾叶桉。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述农杆菌为农杆菌GV3101。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述农杆菌菌液OD600为0.6~1.0。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，叶盘直径为0.8～1.2cm。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟子倩，黄真池，李柳如，黄俊文，
申请(专利权)人：岭南师范学院，
类型：发明
国别省市：广东,44