制备单倍体和随后的双单倍体植物的方法技术

据发现由于导致在Msi2蛋白中引入过早的终止密码子的核苷酸多态性而具有功能丧失性Msi2蛋白的植物能够在与包含功能性Msi2蛋白的野生型植物杂交之后诱导单倍体后代。本发明专利技术涉及单倍体和双单倍体植物的产生。

Methods for preparing haploid and subsequent haploid plants

It is found that plants with functional loss of Msi2 protein can be induced by hybrids with functional Msi2 proteins to induce haploid offspring due to the prematurely terminated codon nucleotide polymorphisms in Msi2 protein. The invention relates to the generation of haploid and haploid plants.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备单倍体和随后的双单倍体植物的方法专利
本公开涉及农业领域。特别地，本公开涉及制备单倍体和随后的双单倍体植物。专利技术背景育种材料中的高度杂合性可以使对有益性状的植物育种和选择成为非常耗时的过程。即使用最新的分子育种工具，大量的群体筛选也是费力和昂贵的。产生单倍体植物然后化学或自发基因组加倍是解决高杂合性问题的有效方式。这类双单倍体避开至少7代自交，否则需要降低杂合性至可接受的水平。可以通过小孢子培养在一些作物中产生单倍体植物。但是，这是昂贵和耗时的。更重要的是，在许多作物中，小孢子培养方法不可行。在一些作物物种中，可以通过卵细胞的孤雌生殖或通过消除亲代基因组之一获得(双)单倍体植物。但是，这些方法也局限于一些选定的作物，并且双单倍体植物的产率很低。WO2011/044132公开了制备单倍体植物的方法。采用的方法之一是失活或敲除CenH3蛋白。这通过添加N-末端GFP至CenH3蛋白进行，从而产生GFP-CenH3。这也称作“尾部交换”。在与没有这样修饰的N-末端部分的CenH3蛋白的植物杂交时尾部交换足以诱导单亲基因组消除。单亲基因组消除导致产生单倍体植物。到目前为止这种方法仅在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)中证实，并未在作物中证实。此外，当将由不同转基因修饰的N-末端部分的CenH3蛋白组成的另一人工构建体引入具有没有内源性CenH3的遗传背景的植物时，看来这并未导致单亲基因组消除以及随后产生单倍体植物(WO2014/110274)。因此难以捉摸CenH3蛋白的哪个修饰对于单亲基因组消除是足够的。因此，本领域需要允许高效产生随后可以加倍的单倍体植物的方法，以便产生双单倍体植物。用双单倍体制备系统，在一代中实现纯合性。专利技术概述本专利技术人现在已发现由于番茄(Solanumlycopersicum)Msi2蛋白中位置126处导致K至STOP密码子氨基酸修饰的独特单核苷酸多态性而具有功能丧失性Msi2蛋白的番茄植物能够在与包含功能性Msi2蛋白的野生型植物杂交之后诱导单倍体后代。通过计算方法发现Msi2蛋白中导致K至M氨基酸修饰的单核苷酸多态性是非破化性的(SIFT,KumarP,HenikoffS,NgPC.(2009)Predictingtheeffectsofcodingnon-synonymousvariantsonproteinfunctionusingtheSIFTalgorithm.NatProtoc；4(7):1073-81)。与这些模型一致，后一氨基酸修饰在与Msi2蛋白中没有该特定K至M氨基酸修饰的野生型植物杂交之后不诱导单倍体后代。与不改变氨基酸序列的同义单核苷酸多态性(Msi2D337D)相互对照杂交不产生任何单倍体后代。在第一方面，本专利技术涉及包含功能丧失性突变的植物来源的Msi2蛋白。所述突变可以存在于WD40重复和/或CAF1C结构域中。所述Msi2蛋白可以由具有功能丧失性突变的植物Msi2蛋白编码多核苷酸编码，当存在于没有其内源性Msi2蛋白的植物中时，当所述植物与野生型植物杂交时，所述蛋白允许产生一些单倍体子代或具有异常倍性的子代。所述Msi2蛋白可以源自包含SEQIDNO:1或10的氨基酸序列或其变体的多肽，所述变体与SEQIDNO:1或10的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％或99％序列相同性，所述蛋白由具有功能丧失性突变的植物Msi2蛋白编码多核苷酸编码，当存在于没有其内源性Msi2蛋白的植物中时，当所述植物与野生型植物杂交时，所述蛋白允许产生一些单倍体子代或具有异常倍性的子代。所述Msi2蛋白可以源自包含SEQIDNO:2或3的氨基酸序列或其变体的多肽，所述变体与SEQIDNO:2或3的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％或99％序列相同性，所述蛋白由具有功能丧失性突变的植物Msi2蛋白编码多核苷酸编码，当存在于没有其内源性Msi2蛋白的植物中时，当所述植物与野生型植物杂交时，所述蛋白允许产生一些单倍体子代或具有异常倍性的子代。例如，所产生的子代的至少0.1、0.5、1或5％是单倍体，或者具有异常倍性，或者是双单倍体。功能丧失性突变可以引入引起所述蛋白截短的过早的终止密码子。例如，所述蛋白可以在SEQIDNO:2、3或10中位置125处的氨基酸残基之后截短，或者在SEQIDNO:1中位置123处的氨基酸残基之后截短。在实施方案中，Msi2蛋白包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或由SEQIDNO:6的氨基序列组成。在实施方案中，Msi2蛋白可以由包含SEQIDNO:4或9的核酸序列的核酸分子编码。Msi2蛋白可以由包含功能丧失性突变的多核苷酸编码，所述多核苷酸利用靶向核苷酸交换或通过应用内切核酸酶衍生自编码内源性Msi2蛋白的多核苷酸。在另一方面，本专利技术提供编码本文教导的Msi2蛋白的核酸分子。本专利技术还提供包含SEQIDNO:5、7或8的核酸序列或其变体的核酸分子，所述变体与SEQIDNO:5、7或8的核酸序列具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％或99％序列相同性，其中将SEQIDNO:5、7或8的核酸序列的一个或多个核苷酸修饰，从而核酸分子编码包含功能丧失性突变的Msi2蛋白。本专利技术还提供包含SEQIDNO:5、7或8的核酸序列或其变体的核酸分子，所述变体与SEQIDNO:5、7或8的核酸序列具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％或99％序列相同性，其中将一个或多个核苷酸修饰，从而引入过早的终止密码子并且核酸分子编码截短的Msi2蛋白。在实施方案中，将在SEQIDNO:5或7的核酸序列的位置376、377和/或378处的一个或多个核苷酸，或者在SEQIDNO:8的核酸序列的位置685、686和/或687处的一个或多个核苷酸修饰，从而引入终止密码子，并且核酸分子编码包含在对应于SEQIDNO:2或3中位置125的氨基酸残基之后截短的氨基酸序列的多肽。还教导包含SEQIDNO:4或9的核酸序列的核酸分子。本文教导的核酸分子可以是分离的核酸、基因组核酸或cDNA。本专利技术进一步提供包含本文教导的核酸分子的嵌合基因，以及包含本文教导的核酸分子或本文教导的嵌合基因的载体。本专利技术进一步涉及包含本文教导的核酸分子、本文教导的嵌合基因或本文教导的载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是植物细胞，包括原生质体，优选番茄植物细胞。还公开了包含如本文教导的核酸分子、如本文教导的嵌合基因或如本文教导的载体的植物、种子或植物细胞。在实施方案中，内源性Msi2蛋白在所述植物、种子或植物细胞中不表达。本专利技术还涉及植物、种子或植物细胞，其中内源性Msi2蛋白不表达，例如，其中将内源性Msi2基因敲除。在实施方案中，所述植物、种子或植物细胞不是拟南芥植物、种子或植物细胞。所述植物、种子或植物细胞可以是茄属植物、种子或植物细胞，优选番茄植物、种子或植物细胞。本专利技术进一步涉及一种制备如本文教导的植物、种子或植物细胞的方法，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含功能丧失性突变的植物来源的Msi2蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.02 NL 20155491.包含功能丧失性突变的植物来源的Msi2蛋白。2.权利要求1的Msi2蛋白，其中所述突变存在于WD40重复和/或CAF1C结构域中。3.权利要求1或2中任一项的Msi2蛋白，其由具有功能丧失性突变的植物Msi2蛋白编码多核苷酸编码，当存在于没有其内源性Msi2蛋白的植物中时，当所述植物与野生型植物杂交时，所述蛋白允许产生一些单倍体子代或具有异常倍性的子代。4.前述权利要求中任一项的Msi2蛋白，其源自包含SEQIDNO:1或10的氨基酸序列或其变体的多肽，所述变体与SEQIDNO:1或10的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％或99％序列相同性，所述蛋白由具有功能丧失性突变的植物Msi2蛋白编码多核苷酸编码，当存在于没有其内源性Msi2蛋白的植物中时，当所述植物与野生型植物杂交时，所述蛋白允许产生一些单倍体子代或具有异常倍性的子代。5.前述权利要求中任一项的Msi2蛋白，其源自包含SEQIDNO:2或3的氨基酸序列或其变体的多肽，所述变体与SEQIDNO:2或3的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％或99％序列相同性，所述蛋白由具有功能丧失性突变的植物Msi2蛋白编码多核苷酸编码，当存在于没有其内源性Msi2蛋白的植物中时，当所述植物与野生型植物杂交时，所述蛋白允许产生一些单倍体子代或具有异常倍性的子代。6.权利要求4-5中任一项的Msi2蛋白，其中所产生的子代的至少0.1、0.5、1或5％是单倍体，或者具有异常倍性，或者是双单倍体。7.前述权利要求中任一项的Msi2蛋白，其中所述功能丧失性突变引入导致蛋白截短的过早的终止密码子。8.权利要求7的Msi2蛋白，其中所述蛋白在SEQIDNO:2、3或10中的位置125处的氨基酸残基之后截短，或者在SEQIDNO:1中的位置123处的氨基酸残基之后截短。9.由SEQIDNO:6的氨基酸序列组成的Msi2蛋白。10.权利要求8-9中任一项的Msi2蛋白，其由包含SEQIDNO:4或9的核酸序列的核酸分子编码。11.前述权利要求中任一项的Msi2蛋白，其由包含功能丧失性突变的多核苷酸编码，所述多核苷酸利用靶向核苷酸交换或通过应用内切核酸酶衍生自编码内源性Msi2蛋白的多核苷酸。12.编码前述权利要求中任一项的Msi2蛋白的核酸分子。13.包含SEQIDNO:5、7或8的核酸序列或其变体的核酸分子，所述变体与SEQIDNO:5、7或8的核酸序列具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％或99％序列相同性，其中将SEQIDNO:5、7或8的核酸序列的一个或多个核苷酸修饰，从而核酸分子编码包含功能丧失性突变的Msi2蛋白。14.包含SEQIDNO:5、7或8的核酸序列或其变体的核酸分子，所述变体与SEQIDNO:5、7或8的核酸序列具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％或99％序列相同性，其中将一个或多个核苷酸修饰，从而引入过早的终止密码子并且核酸分子编码截短的Msi2蛋白。15.权利要求14的核酸分子，其中将在SEQIDNO:5或7的核酸序列的位置376、377和/或378处的一个或多个核苷酸，或者在SEQIDNO:8的核酸序列的位置685、686和/或687处的一个或多个核苷酸修饰，从而引入终止密码子，并且核酸分子编码包含在对应于SEQIDNO:2或3中位置125的氨基酸残基之后截短的氨基酸序列的多肽。16.包含SEQIDNO:4或9的核酸序列的核酸分子。17.权利要求12-16中任一项的核酸分子，其是分离的核酸、基因组核酸或cDNA。18.包含权利要求12-17中任一项的核酸分子的嵌合基因。19.包含权利要求12-17中任一项的核酸分子或权利要求18的嵌合基因的载体。20.包含权利要求12-17中任一项的核酸分子、权利要求18的嵌合基因或权利要求19的载体的宿主细胞。21.权利要求20的宿主细胞，其是植物细胞，优选番茄植物细胞。22.包含权利要求12-17中任一项的核酸分子、权利要求18的嵌合基因或权利要求19的载体的植物、种子或植物细胞。23.权利要求22的植物、种子或植物细胞，其中内源性Msi2蛋白不表达。...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·H·M·奥普德恩坎普，P·J·范戴克，A·加勒德，
申请(专利权)人：主基因有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL