用于快速植物转化的方法和组合物技术

本披露涉及用于快速和有效转化植物的方法和组合物。本披露进一步提供用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；(ii)编码包含两个AP2‑DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。本摘要旨在作为扫描工具用于在特定领域中进行搜索的目的，而不旨在限制本披露。

Methods and compositions for rapid plant transformation

The disclosure relates to methods and compositions for rapid and effective transformation of plants. The present disclosure further provides a method for producing transgenic plants, including: (a) the expression of a cell that constructs a body to transform the explant into a nucleotide sequence containing (I) encoding a WUS/WOX homologous frame polypeptide, and (II) encoding a nucleotide sequence of a polypeptide containing two AP2 DNA binding domains; or (III) (I). And (II) combination; and (b) in the absence of exogenous cytokinin, the polypeptides allowed (a) were expressed in each transformed cell to form a renewable plant structure, of which no callus was formed; and (c) the regenerative plant structure was sprout to form the described transgenic plant. This abstract is intended to be used as a scanning tool for search purposes in specific areas, rather than limiting the disclosure.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于快速植物转化的方法和组合物
本披露总体上涉及植物分子生物学领域，包括植物的基因操作。更具体地，本披露涉及在不存在细胞分裂素并且没有愈伤组织形成的情况下用于生产转化的植物的快速、高效的方法和组合物。相关申请的交叉引用本申请要求于2015年10月30日提交的美国临时申请号62/248578的优先权，该申请以其全文通过引用特此结合中。对经由EFS-Web作为文本文件提交的序列表的引用该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，该序列表文件名为“20160826_6752WOPCT_SeqList.txt”，创建于2016年8月17日，且具有1000KB大小，并与本说明书同时提交。包括在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用结合在此。
技术介绍
过去几年来在植物转化方面取得了的重要进展。多种农艺学上重要的植物(例如，玉米、大豆、低芥酸菜籽、小麦、籼稻、甘蔗和高粱、以及近交系)的转化依然是困难且耗时的。传统上，引起培养反应的唯一方法是通过优化培养基组分和/或外植体材料和来源。这导致了一些基因型的成功，但是许多重要的作物植物(包括优良近交系或品种)都未能产生有利的培养反应。尽管模式基因型的转化可能是有效的，但是将转基因渐渗入生产近交系的过程是费力、昂贵且耗时的。如果可以将基因引入并以更高的速度和效率进行评估，那将节省大量的时间和金钱。尽管有局限性，单子叶植物(例如玉米、稻、和小麦)的农杆菌(Agrobacterium)介导的转化仍然是一种广泛使用的实验方法，通常使用分生组织(例如未成熟胚)作为选择的外植体(例如Ishida等人，1996；Zhao等人，2001；Frame等人，2002)。对于稻，还报道了吸胀种子的转化(Toki等人，2006)。迄今为止，用于将细胞与农杆菌接触的最常用方法包括：培养外植体组织(例如，未成熟胚)(“共培养”)，其可能包括“延迟”或“静止”(非选择性)步骤，接着在选择培养基(含有一种或多种允许细胞脱分化形成愈伤组织的生长素)上进行培养。在该愈伤化阶段期间，在选择培养基上存在适当的选择剂的情况下选择转化的抗性愈伤组织。接着在再生和生根培养基中在促进愈伤组织分化和愈伤组织再生成植物的条件下使细胞生长。该过程通常需要至少10-12周来生产可以转移至土壤供进一步生长的植物。该过程还需要在整个转化过程中进行若干次组织的手动转移，并使用若干种不同类型的培养基。因此，使用标准转化和再生方案是耗时且低效的，并且负面地影响转基因产品开发时间表，考虑到通常存在季节性限制的“优先开发窗口(prioritydevelopmentwindow)”用于根据初步研究中获得的结果决定哪些遗传构建体优先用于更大规模的田间工作。可用的转化和再生的标准方法具有多种限制可以生产和筛选转基因植物的速度和效率的缺点。例如，许多转化和再生的标准方法需要使用高生长素或细胞分裂素水平，并且需要涉及胚性愈伤组织形成或器官发生的步骤，导致在转化后在生产用于在温室环境中生长的植物之前花费许多周的程序。据报道(Zhong等人(1992)Planta[植物]187：490-497)，此类方法可能花费12-23周来生产植物，其包括以下步骤：供应2，4-D以刺激玉米的体细胞胚形成(占用8周)、从初级体细胞胚产生胚性愈伤组织(占用另外的8周)、形成芽(占用另外的3周)、并最终生根(占用另外的1至3周)。可替代地，Zhong等人立即供应细胞分裂素以及生长素，以刺激直接形态发生而产生芽和直接植物形成(从8至28周)(Zhong等人(1992)Planta[植物]187：490-497)。尽管植物分子生物学(尤其是植物转化和再生方法)中的进展，仍然需要高通量系统来快速且有效地生产转基因植物，来为进行研究和产品开发的决定提供更多的时间和灵活性。这样的用于转化的高通量系统促进生产大量的转基因植物用于基因测试和/或产品开发，同时降低材料和人工成本。
技术实现思路
在各个方面，本披露进一步提供了用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使可再生植物结构发芽以形成转基因植物。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列两者。在一方面，表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列。在一方面，表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2结合结构域的多肽的核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。在一方面，表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。在一方面，位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153。在一方面，位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。在一方面，非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。在一方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMVPROFL、UBIZMPRO、SI-UB3PRO、SB-UBIPRO(ALT1)、USB1ZMPRO、ZM-GOS2PRO、ZM-H1BPRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADFPRO(ALT2)。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。在一方面，与编码位点特异性重组酶的核苷酸序列和/或编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列和/或编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列可操作地连接的发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2‑DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.30 US 62/2485781.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含：(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；并且(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。2.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)其组合；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物；其中所述WUS/WOX同源框多肽包含SEQIDNO：4、6、8、10、12、14或16中的任一个的氨基酸序列；或其中所述WUS/WOX同源框多肽由SEQIDNO：3、5、7、9、11、13或15中的任一个的核苷酸序列编码；并且其中所述包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽包含SEQIDNO：18、20、63、65或67中的任一个的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQIDNO：17、19、21、62、64、66或68中的任一个的核苷酸序列编码。3.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS2多肽的核苷酸序列；或(ii)编码ODP2多肽的核苷酸序列；或(iii)其组合；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物；其中所述WUS2多肽包含SEQIDNO：4的氨基酸序列；或其中所述WUS2多肽由SEQIDNO：3的核苷酸序列编码；并且其中所述ODP2多肽包含SEQIDNO：18的氨基酸序列；或其中包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽由SEQIDNO：17或21中的任一个的核苷酸序列编码。4.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。5.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。6.一种用于生产转化的植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；并且(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)使所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。7.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列；或(iii)(i)和(ii)的组合；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成；并且(c)在约14天至约60天内使(b)的所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。8.一种用于生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用表达构建体转化外植体的细胞，所述表达构建体包含(i)编码WUS/WOX同源框多肽的核苷酸序列；或(ii)编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的核苷酸序列：或(iii)(i)和(ii)的组合；(b)在不存在外源性细胞分裂素的情况下，允许(a)的多肽在每个转化的细胞中表达以形成可再生植物结构，其中没有愈伤组织形成，并且其中所述可再生植物结构在转化所述细胞的约0-7天或约0-14天内形成；并且(c)在转化所述细胞的约14天至约60天内使(b)的所述可再生植物结构发芽以形成所述转基因植物。9.如权利要求1-3或6-8中任一项所述的方法，其中所述表达构建体包含编码所述WUS/WOX同源框多肽的所述核苷酸序列和编码所述包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的所述核苷酸序列两者。10.如权利要求1-4或6-9中任一项所述的方法，其中所述表达构建体包含编码所述WUS/WOX同源框多肽的所述核苷酸序列。11.如权利要求1-3或5-9中任一项所述的方法，其中所述表达构建体包含编码所述包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的所述核苷酸序列。12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中编码所述WUS/WOX同源框多肽的所述核苷酸序列和/或编码所述包含两个AP2结合结构域的多肽的所述核苷酸序列的表达发生在转化起始后少于1天、少于2天、少于5天、少于7天、或少于约14天。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述表达构建体进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。14.如权利要求13所述的方法，其中所述位点特异性重组酶选自：FLP、Cre、SSV1、λInt、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1或U153。15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述位点特异性重组酶是非稳定的融合多肽。16.如权利要求15所述的方法，其中所述非稳定的融合多肽是TETR(L17G)～CRE或ESR(L17G)～CRE。17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其中编码位点特异性重组酶的所述核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。18.如权利要求1-4、6-10或12-17中任一项所述的方法，其中编码所述WUS/WOX同源框多肽的所述核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。19.如权利要求1-3、5-9或11-17中任一项所述的方法，其中编码包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽的所述核苷酸序列可操作地连接至组成型启动子、诱导型启动子、或发育调节型启动子。20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述组成型启动子选自：UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMVPROFL、UBIZMPRO、SI-UB3PRO、SB-UBIPRO(ALT1)、USB1ZMPRO、ZM-GOS2PRO、ZM-H1BPRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35S的-135版本、或ZM-ADFPRO(ALT2)。21.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子选自：AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、或由四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子。22.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A或LEA-D34。23.如权利要求17-19或21中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子是化学诱导型启动子。24.如权利要求23所述的方法，其中所述化学诱导型启动子是XVE。25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述化学诱导型启动子被TETR、ESR或CR阻抑，并且去阻抑发生在添加四环素相关的配体或磺酰脲配体后。26.如权利要求25所述的方法，其中所述阻抑物是TETR，并且所述四环素相关的配体是多西环素或脱水四环素。27.如权利要求25所述的方法，其中所述阻抑物是ESR，并且所述磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲磺胺磺隆、或氯吡嘧磺隆。28.如权利要求17-19或21中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子是生长素诱导型启动子。29.如权利要求28所述的方法，其中所述生长素诱导型启动子是AXIG1。30.如权利要求29所述的方法，其中所述AXIG1启动子包含SEQIDNO：39的核苷酸序列。31.如权利要求17-19、21或28-30中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子包含生长素响应元件。32.如权利要求17-19、21、28或31中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子含有一个或多个DR5增强子基序。33.如权利要求17-19、21或25-32中任一项所述的方法，其中所述启动子是经修饰用于阻抑和去阻抑的弱组成型启动子。34.如权利要求33所述的方法，其中所述启动子中的一个或多个操纵子序列已经位于TATA盒和/或转录起始位点附近或与其重叠。35.如权利要求33所述的方法，其中所述启动子选自：NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PRO或ZM-ADF4-PRO。36.如权利要求17-19、21、28或31-32中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子是包含SEQIDNO：40的核苷酸序列的DR5启动子。37.如权利要求17-19、21或33中任一项所述的方法，其中所述启动子是去阻抑型启动子。38.如权利要求17-19、21、25-27、33或37中任一项所述的方法，其中所述去阻抑型启动子是TETR、ESR或CR。39.如权利要求17-19或22中任一项所述的方法，其中所述发育调节型启动子选自：PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3。40.如权利要求22或39所述的方法，其中所述PLTP、PLTP1、PLTP2或PLTP3启动子源自单子叶植物。41.如权利要求40所述的方法，其中所述单子叶植物是大麦、玉米、粟、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种(Setariasp.)、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦、草坪草、或小麦。...

【专利技术属性】
技术研发人员：A阿南德，ML阿林格，A达斯瓦康塞曹，WJ戈当卡姆，C哈斯廷格斯，GJ霍尔斯特，TM克莱恩，CM拉罗塔，KS洛维，SB蒂瓦里，王宁，XE吴，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国,US