转CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鉴定及应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程及分子植物育种领域，提供包括有CmWRKY15‑1基因的重组载体、转化细胞、转CmWRKY15‑1基因切花菊的培育、鉴定方法及应用。转CmWRKY15‑1基因切花菊的培育方法包括如下步骤：（1）菊花CmWRKY15‑1基因的克隆（2）植物表达载体PBI121‑CmWRKY15‑1的构建（3）农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花。对转化植株进行PCR、定量RT‑PCR检测证实CmWRKY15‑1基因已整合到转基因植株基因组DNA中并发生转录。对转基因植株进行抗病性检测，转基因植株抗白色锈病能力明显提高，为选育抗病新品种菊花提供切实可行的方法。

Cultivation, identification and application of transgenic CmWRKY15-1 cut chrysanthemum

The invention belongs to the field of plant genetic engineering and molecular plant breeding, and provides a recombinant vector containing CmWRKY15_1 gene, a transformed cell, a cultivation, identification method and application of a cut chrysanthemum with CmWRKY15_1 gene. The cultivation method of CmWRKY15 1 transgenic cut chrysanthemum includes the following steps: (1) Cloning of CmWRKY15 1 gene of chrysanthemum; (2) Construction of plant expression vector PBI 121 CmWRKY15 1; (3) Agrobacterium tumefaciens EHA105-mediated leaf disc transformation of chrysanthemum. PCR and quantitative RT_PCR analysis showed that CmWRKY15_1 gene was integrated into the genomic DNA of transgenic plants and transcribed. The resistance of transgenic plants to white rust was significantly improved by testing the disease resistance of transgenic plants, which provided a feasible method for breeding a new disease-resistant variety Chrysanthemum.

【技术实现步骤摘要】
转CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鉴定及应用
本专利技术属于植物基因工程及分子植物育种领域，涉及一种通过转CmWRKY15-1基因提高菊花抗白色锈病能力的方法，具体涉及转CmWRKY15-1基因的重组载体、转化细胞、转CmWRKY15-1基因的切花菊的培育鉴定及应用。
技术介绍
菊花（Chrysanthemummorifolium）是我国十大名花之一，种类丰富，被广泛的应用于园林绿化及切花生产中。不同品种菊花的性状差异较大，很多观赏性强、经济价值高的菊花不能够兼具良好的抗逆性及抗病性。分子植物育种的诞生，为快速高效的选育出具有优良性状的菊花提供了新方法，其可通过转基因技术手段，将特定的基因整合到植株的基因组中，从而改变植物的生物学特性，获得具有特定性状的转基因植株。WRKY转录因子是植物十大转录因子家族之一，最初由Ishiguro等人在甘薯中发现（1994），后来相继有学者研究发现WRKY转录因子参与到植物的抗生物胁迫及非生物胁迫响应中，增强植物自身的抗病能力及抗逆性。目前已发现在拟南芥、烟草、水稻等植物中过表达WRKY基因能够增强植物的耐盐性、耐旱性和耐寒性等抗逆能力。另一方面，WRKY转录因子能够通过直接调控抗病基因的表达或参与激素介导的信号转导途径从而改变植物的抗病能力。在拟南芥中，WRKY基因能够增强其对野火病菌、灰霉病菌、青枯病菌、枯萎病菌等病原菌的抗性（Deslandesetal.，2002；Xuetal.，2006；LeRouxetal.，2015；Karimetal.，2015）。在水稻中，过量表达WRKY基因能够显著提高水稻对稻瘟病和白叶枯病的抵抗力（Encinas-Villarejoetal.，2009；Jingetal.，2009）。此外，WRKY基因还能够抗番茄叶卷曲病（Mandaletal.，2015）、葡萄霜霉病（Merzetal.，2015）、白粉病（乔恒波，2016）、柑橘溃疡病（周鹏飞等，2017）等多种植物病害。在菊花中，关于WRKY基因功能的研究尚不多见。DgWRKY5和CmWRKY1基因能够增强菊花的耐盐性和耐旱性（田效琴，2016；范青青，2016）。在菊花中过表达CmWRKY48基因和CmWRKY15基因，增强了菊花对蚜虫的防御机制和对黑斑病的敏感性（Lietal.，2015；范青青，2016）。菊花白色锈病是菊花重要病害之一，其传播范围广、危害性大，一旦发病将使植株叶片干枯下卷甚至变黑，引起大规模植株死亡（Whippsetal.，1993）。目前，关于WRKY基因增强菊花抗白色锈病的能力的相关研究尚未见报道。针对目前实际生产中菊花抗白色锈病能力较弱，且尚未有相关研究提供WRKY基因增强菊花抗白色锈病能力的理论依据，本专利技术提出一种转CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鉴定方法及应用。参考文献：1.IshiguroS,NakamuraK.1994.CharacterizationofacDNAencodinganovelDNA-bindingprotein,SPF1,thatrecognizesSP8sequencesinthe5’upstreamregionsofgenescodingforsporaminandbeta-amylasefromsweetpotato[J].Mol.GenGenet,244(6):563-571.2.DeslandesL,OlivierJ,TheulieresF,etal.2002.ResistancetoralstoniasolanacearuminarabidopsisthalianaisconferredbytherecessiveRRS1-Rgene，amemberofanovelfamilyofresistancegenes[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,99(4):2404-2409.3.XuX,ChenC,FanB,etal.2006.Physicalandfunctionalinteractionbetweenpathogen-inducedArabidopsisWRKY18,WRKY40,andWRKY60transcriptionfactors[J].ThePlantCell,18(5):1310-1326.4.LeRouxC,HuetG,JauneauA,etal.2015.Areceptorpairwithanintegrateddecoyconvertspathogendisablingoftranscriptionfactorstoimmunity[J].Cell,161(5):1074-1088.5.KarimA,JiangYZ,GuoL,etal.2015.IsolationandcharacterizationofasubgroupIIaWRKYtranscriptionfactorPtrWRKY40fromPopulustrichocarpa[J].TreePhysiology,35(10):1129-1139.6.Encinas-VillarejoS,MaldonadoAM,Amil-RuizF,etal.2009,Evidenceforapositiveregulatoryroleofstrawberry(Fragaria×ananassa)FaWRKY1andArabidopsisAtWRKYproteinsinresistance[J].JournalofExperimentalBotany,60(11):3043-3065.7.JingSJ,ZhouX,SongY,etal.2009.HeterologousexpressionofOsWRKY23geneenhancespathogendefenseanddark-inducedleafsenescenceinArabidopsis[J].PlantGrowthRegulation,58(2):181-190.8.MandalA.SarkarD,KunduP,etal.2015.MechanismofregulatinoftomatoTRN1geneexpressioninlateinfectionwithtomatoleafcurlNewDelhivirus[J].PlantScience,241:221-237.9.MerzPR,MoserT,HöllJ,etal.2015.(Vitis ThetranscriptionfactorVvWRKY33isinvolvedintheregulationofgrapevinedefenseagainsttheoomycetepathogen vinifera)Plasmoparaviticola[J].PhysiologiaPlantarum,153(3):365-380.10.乔恒波.2016.中国野生毛葡萄转录因子WRKY3基因克隆与功能研究[D].西北农林科技大学.11.周鹏飞,贾瑞瑞,陈善春,等.2017.柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析[J].园艺学报,44本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组载体，其特征在于：该重组载体包括序列如SEQ ID NO.1所示CmWRKY15‑1基因，通过DNA连接酶将CmWRKY15‑1基因连接到载体。

【技术特征摘要】
1.一种重组载体，其特征在于：该重组载体包括序列如SEQIDNO.1所示CmWRKY15-1基因，通过DNA连接酶将CmWRKY15-1基因连接到载体。2.包括有权利要求1所述的转化细胞。3.一种转CmWRKY15-1基因切花菊的培育方法，其特征在于：该方法以菊花白色锈病高抗品种‘双粉匙’为材料获得抗病基因CmWRKY15-1，通过酶切连接与植物表达载体PBI121质粒进行重组连接，通过农杆菌介导法将CmWRKY15-1基因导入菊花。4.一种转CmWRKY15-1基因切花菊的培育方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：（1）菊花CmWRKY15-1基因的克隆以抗病品种‘双粉匙’叶片为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据转录组测序所得到的序列信息设计特异引物：上游引物CmWRKY15-1-F：序列如SEQIDNO.2所示下游引物CmWRKY15-1-R：序列如SEQIDNO.3所示；获得CmWRKY15-1基因序列；结合PCR扩增目的基因的全长序列，设计引物：上游引物CmWRKY15-1-2F：序列如SEQIDNO.4所示下游引物CmWRKY15-1-2R：序列如SEQIDNO.5所示；在CmWRKY15-1基因的上游和下游分别引入XbaI和SacI酶切位点获得PCR产物；（2）植物表达载体PBI121-CmWRKY15-1的构建将步骤（1）获得的PCR产物连接到pTOPO-T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；用限制性内切酶XbaI和SacI分别对提取的质粒及PBI121载体进行双酶切，PCR电泳检测回收酶切产物，然后用T4连接酶连接过夜，连接产物转化DH5α大肠杆菌，提取阳性质粒进行双酶切验证；（3）农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花将步骤（2）制备的阳性质粒PBI121-CmWRKY15-1转化农杆菌感受态EHA105，获得阳性克隆农杆菌，通过叶盘法转化菊花，将CmWRKY15-1基因转入菊花中，获得转CmWRKY15-1基因切花菊。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：毛洪玉，延昕，刘迪，祝朋芳，熊超明，毕蒙蒙，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21