【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用乙醇促进乳酸菌全细胞谷氨酸脱羧酶活力的方法，属于生物工程领域。
技术介绍
1、谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，gad，ec4.1.1.15）能专一地催化 l-谷氨酸（ l-glutamic acid, l-glu）α-羧基发生脱羧作用，在 γ-氨基丁酸（ γ-aminobutyricacid, gaba）生物合成和手性物质 dl-谷氨酸（ dl-glutamic acid， dl-glu）的拆分方面具有重要应用。微生物具有生长繁殖快、代谢过程特殊和易培养等特点，利用微生物生产产品不受资源、环境和空间限制，因此对微生物源gad的挖掘和应用备受关注，特别是乳酸菌因其较高的安全性而深受青睐。大量研究表明短乳杆菌（ lactobacillus brevis）、副干酪乳杆菌（ lactobacillus paracasei）、鼠李糖乳杆菌（ lactobacillus rhamnosus）、清酒乳杆菌（ lactobacillus sakei）、唾液链球菌嗜热亚种（ streptococcus salivarius ssp.
2、对于底物和产物均是小分子的微生物胞内酶的应用，通常有游离酶法、固定化酶法和全细胞转化法。游离酶或固定化酶法均需要破碎细胞提取细胞酶，酶提取纯化难度大、成本高；全细胞转化法是直接利用微生物细胞进行转化反应，可以减少酶提取工艺过程，并且微生物细胞较游离酶更易从反应液中分离去除，转化反应体系成分较少，利于改善下游提取和纯化工艺。因此，利用乳酸菌全细胞转化法生产gaba或拆分 dl-glu，在工艺和生产成本方面均具有显著优势。然而，由于细胞结构的屏障作用，全细胞转化反应与游离酶催化反应存在较大差别，催化效率普遍较游离酶低，因此如何提升胞内gad催化效率是全细胞转化法亟待解决的技术关键。细胞膜是影响细胞小分子物质的传质速率的主要结构，为了提高全细胞的传质效率，一些文献采用表面活性剂（如triton x-100）【食品科学, 2015, 36(1): 158-163】或有机溶剂（如正丁醇、二甲苯）【高等化学工程学报, 2015, 19(1): 138-144；nano select, 2022, 3(10): 1436-1447】对细胞进行透性化处理，破坏细胞膜的完整性，增加细胞的渗透性，结果全细胞gad的表观活力有所提高。表面活性剂或二甲苯对gad的稳定性和活力均有一定不利作用，故对透性化处理剂的浓度、透性化处理的时间等条件要求苛刻，透性化处理后需要及时离心分离和洗涤细胞，工艺过程繁琐，工业透性化处理细胞的透性程度和批次间的一致性难以控制，而且正丁醇和二甲苯安全性低，其残留将影响产品在食品或医药中应用的安全性。
3、由此可见，专利技术一种经济、绿色和安全的促进乳酸菌全细胞gad活力的方法对提升d-glu和gaba工业化生产具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种利用乙醇促进乳酸菌全细胞谷氨酸脱羧酶活力的方法，该方法采用绿色安全的溶剂—乙醇作为全细胞谷氨酸脱羧酶促进剂，提高乳酸菌全细胞gad活力，既不改变原全细胞转化反应工艺工程，又解决了全细胞转化反应gad活力不高的问题。
2、经对来自我国微生物菌种保藏中心的屎肠球菌（ enterococcus faecium）、短乳杆菌（ lactobacillus brevis）、副干酪乳杆菌（ lactobacillus paracasei）、鼠李糖乳杆菌（ lactobacillus rhamnosus）、清酒乳杆菌（ lactobacillus sakei）、唾液链球菌嗜热亚种（ streptococcus salivarius ssp. thermophilus）、戊糖片球菌（ pediococcus pentosaceus）和植物乳杆菌（ lactobacillus plantarum）等乳酸菌进行试验，乙醇对不同属中的乳酸菌的全细胞gad活力均具有显著的促进作用，乳酸菌全细胞gad相对活力可提高30%以上。经对埃希氏大肠杆菌（ escherichia coli）、巨大芽孢杆菌（ bacillus megaterium）等进行试验，乙醇对这些非乳酸菌细菌全细胞gad同样具有显著促进作用。本专利技术主要以屎肠球菌（ enterococcus faecium）为代表，对本专利技术方法进行陈述。
3、为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
4、该制备方法所采用的技术路线为：
5、乳酸菌培养→离心收集菌体→全细胞悬液制备→全细胞、底物和乙醇混合均匀→共反应（转化反应）→终止反应→gaba或d-glu分析与提取。
6、本专利技术方法的具体步骤如下：
7、（1）将乳酸菌按照常规乳酸菌培养方法进行培养；
8、（2）将步骤（1）培养好的发酵醪离心，弃上清液，收集沉淀，即菌体；
9、（3）按照菌体（g）:生理盐水（ml）为1:5的比例将步骤（2）收集的菌体与生理盐水混合，搅拌分散菌体细胞，可加入适量玻璃珠辅助，制成均匀分散的全细胞悬液；
10、（4）按照全细胞悬液:底物水溶液为1:2的比例将步骤（3）制备的全细胞悬液与l-glu或dl-glu底物溶液混匀，然后在不断搅拌条件下加入乙醇溶液至乙醇终浓度为5～10%（体积分数）；
11、（5）将步骤（4）混合溶液在低转速搅拌下保温进行转化反应，并通过缓冲液内源控制或添加酸的外源控制方式适时调整反应体系ph，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用乙醇促进乳酸菌全细胞谷氨酸脱羧酶活力的方法，其特征在于：在利用乳酸菌全细胞谷氨酸脱羧酶生产γ-氨基丁酸或拆分DL-谷氨酸生产D-谷氨酸的共反应体系中添加终体积分数浓度为5%～10%的乙醇，用于促进全细胞谷氨酸脱羧酶活力，提高γ-氨基丁酸或D-谷氨酸的产量。
2.根据权利要求1所述的一种利用乙醇促进乳酸菌全细胞谷氨酸脱羧酶活力的方法，其特征在于：所述反应体系乙醇的终体积分数浓度为5%～10%，优选7.5%。
3. 根据权利要求1所述的一种利用乙醇促进乳酸菌全细胞谷氨酸脱羧酶活力的方法，其特征在于：所述乳酸菌可为屎肠球菌（Enterococcus faecium）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）、唾液链球菌嗜热亚种（Streptococcus salivarius ssp. thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pento
...【技术特征摘要】
1.一种利用乙醇促进乳酸菌全细胞谷氨酸脱羧酶活力的方法，其特征在于：在利用乳酸菌全细胞谷氨酸脱羧酶生产γ-氨基丁酸或拆分dl-谷氨酸生产d-谷氨酸的共反应体系中添加终体积分数浓度为5%～10%的乙醇，用于促进全细胞谷氨酸脱羧酶活力，提高γ-氨基丁酸或d-谷氨酸的产量。
2.根据权利要求1所述的一种利用乙醇促进乳酸菌全细胞谷氨酸脱羧酶活力的方法，其特征在于：所述反应体系乙醇的终体积分数浓度为5%～10%，优选7.5%。
3. 根据权利要求1所述的一种利用乙醇促进乳酸菌全细胞谷氨酸脱羧酶活力的方法，其特征在于：...
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