一种皮张中古DNA的提取方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种皮张中古DNA的提取方法，包括样品预处理步骤、消化蛋白步骤、吸附步骤及洗脱步骤；所述消化蛋白步骤采用proteinK/EDTA消化液，所述protein K/EDTA消化液为包含蛋白酶K、EDTA、Tween 20的水溶液；所述吸附步骤采用的吸附体系包含Binding buffer、乙酸钠溶液、以及浸泡于所述Binding buffer和乙酸钠的混合液中的带滤膜的吸附柱；所述Binding buffer为包含盐酸胍、异丙醇或无水乙醇、Tween20的水溶液；所述滤膜为硅基质滤膜；所述洗脱步骤采用TET洗脱液，所述TET洗脱液是包含三羟甲基氨基甲烷‑HCl、EDTA、Tween 20的水溶液。本发明专利技术方法与现有技术相比，在古皮张样品相同情况下，可获得现有技术12倍以上DNA分子总量，因此可用更少的皮张样品用量，提取效率更高。

A method and kit for extracting ancient DNA from skin

The invention relates to a method for extracting medieval DNA from skin tensor, which includes sample pretreatment, protein digestion, protein adsorption and elution steps. The adsorption system comprises a Binding buffer, a sodium acetate solution, and an adsorption column with a filter immersed in the mixture of the Binding buffer and sodium acetate; the Binding buffer is an aqueous solution containing guanidine hydrochloride, isopropanol or anhydrous ethanol, and Tween20; the filter membrane is a silicon matrix filter; the elution step adopts TET The TET eluent is an aqueous solution containing trimethylolamine HCl, EDTA and Tween 20. Compared with the prior art, the method can obtain more than 12 times the total DNA molecule amount of the prior art under the same condition of the paleo-skin sample, so the amount of the skin sample can be reduced and the extraction efficiency is higher.

【技术实现步骤摘要】
一种皮张中古DNA的提取方法及试剂盒
本专利技术涉及一种DNA的提取
，尤其涉及一种古DNA的提取方法及试剂盒。
技术介绍
古DNA是指保存于古生物遗骸中的遗传物质。随着分子生物学的出现，古DNA研究也逐渐进入了考古工作者的视野，为现代与古代生物间谱系发育关系提供直接证据，同时也为研究人类起源与迁徙、动植物的家养与驯化以及农业文明的起源和早期发展等问题提供一个新视角。然而，古DNA的成功提取一直是其中的重点和难点。这主要是由于受保存时间和保存状态的影响，古DNA的含量相对较低且极易受有机物质污染降及解。在此基础上，针对古DNA的提取技术也受到了各种制约，提取的成功与否很大程度上决定了研究的深度和广度。据以往经验，考古遗址中经常会发现动物毛皮，这对研究古代动物与现代动物之间的遗传关系，揭示家养动物的起源与驯化具有重要意义，而考古现场发现或博物馆保存的皮张又因长时间的降解影响，进一步加大了提取难度。皮张古DNA提取技术可为珍稀动物保护遗传学研究提供基础。目前，绝大部分珍稀濒危动物的种群生存状况已相当脆弱，已不允许破坏性取样，因此利用馆藏标本样品用于保护遗传学和系统进化等方面的研究成为解决这一难题的重要途径。虽已有学者从馆藏陈旧皮张标本中成功提取了DNA，但因陈旧皮张中DNA相对含量低及污染问题，使这些方法往往存在着标本样品用量大、提取效果差、实验周期长和操作步骤繁琐等不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的皮张中古DNA的提取方法及试剂盒，能够实现提取时皮张样品用量少、DNA污染低、提取效率高、操作时间短、操作简单、内源DNA获取量较大等目标，从而为考古学研究、珍稀动物保护研究和其他相关领域研究提供了技术保障和支持。为了达到上述目的，本专利技术主要通过选择使用高效的消化液和吸附缓冲液(DNAbindingBuffer)，获取更多的古DNA信息，尤其是不易捕获的短片段DNA信息。由此，既避免了古DNA的污染问题，同时又能高效、便捷地获得含有古DNA的溶液。本专利技术采用的主要技术方案如下：一种皮张中古DNA的提取方法，其包括：样品预处理步骤、消化蛋白步骤、吸附步骤及洗脱步骤；其中：所述消化蛋白步骤采用proteinK/EDTA消化液，所述proteinK/EDTA消化液为包含蛋白酶K、EDTA、Tween20的水溶液；所述吸附步骤采用的吸附体系包含Bindingbuffer、乙酸钠溶液、以及浸泡于所述Bindingbuffer和乙酸钠的混合液中的带滤膜的吸附柱；所述Bindingbuffer为包含盐酸胍、异丙醇或无水乙醇、Tween20的水溶液；所述滤膜为硅基质滤膜；所述洗脱步骤采用TET洗脱液，所述TET洗脱液是包含三羟甲基氨基甲烷-HCl、EDTA、Tween20的水溶液。优选地，所述proteinK/EDTA消化液中，所述proteinK/EDTA消化液中，蛋白酶K的浓度为0.20mg/mL～40mg/mL，EDTA浓度为0.40mol/L～0.60mol/L，Tween20的体积分数为0.03～0.08％。优选地，所述proteinK/EDTA消化液由5体积份的100％Tween20、250体积份的10mg/mL的ProteinaseK、9000体积份的0.5mol/L且pH8.0的EDTA和745体积份的水配制而成。优选地，所述Bindingbuffer中，盐酸胍的浓度为3～7mol/L，异丙醇或无水乙醇的体积分数为30～50％，100％Tween20的体积分数为0.03～0.08％。优选地，所述乙酸钠溶液为2～4mol/L，其使用量为Bindingbuffer体积的2～5％。优选地，所述Bindingbuffer向0.25mol的盐酸胍加水至30mL溶解，再加异丙醇或无水乙醇至50mL，最后加25μl的100％Tween20配制而成。优选地，所述TET洗脱液中，三羟甲基氨基甲烷-HCl的浓度为0.005～0.015mol/L，EDTA浓度为0.0008～0.0012mol/L，Tween20的体积分数为0.03～0.08％。优选地，所述TET洗脱液由1体积份的100％Tween20，20体积份的1mol/LpH＝8.0的三羟甲基氨基甲烷-HCl，4体积份的0.5mol/LpH＝8.0的EDTA，和1975体积份的水配制而成。具体地，配制TET洗脱液的过程为：量取500μl浓度1mol/L且pH＝8.0的三羟甲基氨基甲烷-HCl，再量取100μl浓度0.5mol/LpH＝8.0的EDTA，再滴加25μl的100％Tween20，最后加水至50mL，振荡摇匀即配制完成。根据本专利技术的皮张中古DNA的提取方法，其步骤如下：S1样品预处理步骤：通过该样品预处理步骤获得清洁、无外源有机质污染的皮张样品；S2消化蛋白步骤：将所述proteinK/EDTA消化液加入盛装有皮张样品的离心管中，封口密封，于35～38℃下振荡、温育过夜，以消化本步骤反应体系中的大分子蛋白；高速离心处理去除未溶解的皮张样品，留取上清液；S3吸附：取一定量的所述上清液至盛装有所述Bindingbuffer和乙酸钠溶液的离心管中并混匀得混合液，接着将该混合液转移至容纳有带滤膜的吸附柱的离心管中，低速离心处理，使上清液中DNA与滤膜结合，同时还有少量小分子蛋白也被该滤膜吸附；S4纯化：将所述带滤膜的吸附柱转移至新的离心管中，中速离心处理并弃去离心产出的清液，去除去滤膜上吸附的小分子蛋白；S5清洗纯化：加PE缓冲液至所述吸附柱的滤膜，中速离心处理并弃去离心产出的清液，再次去除滤膜上吸附的小分子蛋白；执行本步骤至少1次；S6洗脱：将盛装所述带滤膜的吸附柱的离心管进行高速离心干燥，再转移所述带滤膜的吸附柱至另一新的离心管内，加TET洗脱液至所述滤膜上，静置、高速离心，离心产生的清液重新加载至该滤膜上，再次静置和高速离心，将滤膜上的DNA洗脱，得到含DNA的溶液。优选地，步骤S5使用的PE缓冲液为购自荷兰凯杰(QIAGEN)公司编号19065号产品。优选地，步骤S1所述的样品预处理步骤包含:S1-1：采用紫外处理过的无DNA、RNA污染的刀片或剪刀剔除掉皮张表层的毛发，并取20～30皮张，剪碎为<1mm3皮张颗粒；S1-2：将所述皮张颗粒置于低DNA吸附离心管中，加1～2ml的70％乙醇，高速震荡洗涤，以＞12000rpm离心0.5min～2min；执行此步骤至少2次；优选地，所述低DNA吸附离心管是eppendorf公司的产品LoBind低DNA吸附管。该低DNA吸附管采用高纯度的聚丙烯材质，减少管壁和DNA样品的结合力，确保接近100％地回收DNA/RNA样品，适用于核酸样品的制备和保存。其中PCRclean洁净级的纯度级别，可直接进行PCR实验制备。LoBind低DNA吸附管显著降低DNA损失，且管无表面涂层，不会污染样品；不含DNA、DNase、RNase和PCR抑制剂(PCRclean洁净级)。S1-3：将步骤S1-22离心管敞口静置于37～40℃培养箱中5min，充分去除残留的乙醇。其中，所述低速离心是指离心转速为1000～2000rpm，优选为1500rpm；中速离心是指离心转速为5000～7000rpm，优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种皮张中古DNA的提取方法，包括样品预处理步骤、消化蛋白步骤、吸附步骤及洗脱步骤；其特征在于：所述消化蛋白步骤采用protein K/EDTA消化液，所述protein K/EDTA消化液为包含蛋白酶K、EDTA、Tween 20的水溶液；所述吸附步骤采用的吸附体系包含Binding buffer、乙酸钠溶液、以及浸泡于所述Binding buffer和乙酸钠的混合液中的带滤膜的吸附柱；所述Binding buffer为包含盐酸胍、异丙醇或无水乙醇、Tween 20的水溶液；所述滤膜为硅基质滤膜；所述洗脱步骤采用TET洗脱液，所述TET洗脱液是包含三羟甲基氨基甲烷‑HCl、EDTA、Tween 20的水溶液。

【技术特征摘要】
1.一种皮张中古DNA的提取方法，包括样品预处理步骤、消化蛋白步骤、吸附步骤及洗脱步骤；其特征在于：所述消化蛋白步骤采用proteinK/EDTA消化液，所述proteinK/EDTA消化液为包含蛋白酶K、EDTA、Tween20的水溶液；所述吸附步骤采用的吸附体系包含Bindingbuffer、乙酸钠溶液、以及浸泡于所述Bindingbuffer和乙酸钠的混合液中的带滤膜的吸附柱；所述Bindingbuffer为包含盐酸胍、异丙醇或无水乙醇、Tween20的水溶液；所述滤膜为硅基质滤膜；所述洗脱步骤采用TET洗脱液，所述TET洗脱液是包含三羟甲基氨基甲烷-HCl、EDTA、Tween20的水溶液。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述proteinK/EDTA消化液中，蛋白酶K的浓度为0.20mg/mL～40mg/mL，EDTA浓度为0.40mol/L～0.60mol/L，Tween20的体积分数为0.03～0.08％。3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述Bindingbuffer中，盐酸胍的浓度为3～7mol/L，异丙醇或无水乙醇的体积分数为30～50％，100％Tween20的体积分数为0.03～0.08％。4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述乙酸钠溶液为2～4mol/L，其使用量为Bindingbuffer体积的2～5％。5.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述TET洗脱液中，三羟甲基氨基甲烷-HCl的浓度为0.005～0.015mol/L，EDTA浓度为0.0008～0.0012mol/L，Tween20的体积分数为0.03～0.08％。6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，其步骤如下：S1样品预处理步骤：通过该样品预处理步骤获得清洁、无外源有机质污染的皮张样品；S2消化蛋白步骤：将所述proteinK/EDTA消化液加入盛装有皮张样品的离心管中，封口密封，于35～38℃下振荡、温育过夜，以消化本步骤反应体系中的大分子蛋白；高速离心处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：付巧妹，曹鹏，戴情燕，
申请(专利权)人：中国科学院古脊椎动物与古人类研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11